比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3及其基因和应用。野生型葡萄糖淀粉酶经定点依次突变后得到热稳定性和催化效率明显提高的多个突变体。本发明专利技术的葡萄糖淀粉酶突变体具有良好的酶学性质，可以应用于饲料、食品、医药等行业。

【技术实现步骤摘要】
比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3及其基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3及其基因和应用。
技术介绍
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。而葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，其系统名称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶(α-1,4-glucanglucohydrolase,EC.3.2.1.3)或γ-淀粉酶(γ-amylase),简称糖化酶。糖化酶从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，即能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业，是我国产量和用量最大的生物酶产品之一，具有很高的商业价值。目前,能源短缺和环境污染极大限制了社会的发展进步，乙醇作为替代能源已逐步被人们所认识，被认为是解决上述问题的有效途径之一。目前通过淀粉生产乙醇的方法包括构建分泌葡萄糖淀粉酶的工程菌株。虽然国内外也有使用混合培养糖化和发酵菌株生产乙醇的发酵生产方式，但此工艺缺点在于菌株自身生长需要消耗大部分的淀粉底物，实际淀粉利用率和乙醇产率依然相当低。葡萄糖淀粉酶能够高效降解α-1,4、α-1,3、α-1,6-糖苷键，从淀粉非还原性末端释放葡萄糖,因此具有很高的商业价值。糖化酶在工业生产中的应用非常广泛，在酒精工业中，糖化酶制剂可代替自制麸曲，简化生产工艺，提高生产效率，糖化酶在轻工、食品、医药、发酵等行业中具有广泛的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供葡萄糖淀粉酶突变体。本专利技术的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶突变体的编码基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶突变体编码基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶突变体编码基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备葡萄糖淀粉酶突变体的方法。本专利技术的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶突变体的应用。根据本专利技术的具体实施方式，本对从TalaromycesleycettanusJCM12802菌株中得到了的葡萄糖淀粉酶TlGA1931进行突变，得到比活和热稳定性提供的萄糖淀粉酶突变体，野生型葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示：根据本专利技术的具体实施方式：将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列的第132位氨基酸由Ser突变为Cys、第492位氨基酸由Tyr突变为Cys、第548位氨基酸由Leu突变为Cys、第562位氨基酸由Ala突变为Cys得到葡萄糖淀粉酶突变体GA1，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的氨基酸序列的第108位氨基酸由Gln突变为Glu得到葡萄糖淀粉酶突变体GA2，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的氨基酸序列的第468、469、470位氨基酸由Ala、Tyr、Ser突变为Asp和Pro得到葡萄糖淀粉酶突变体GA3。根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的氨基酸序列SEQIDNO:2所示：根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示：根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA3的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示：本专利技术提供了编码上述葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体的基因。根据本专利技术的具体实施方式，野生型葡萄糖淀粉酶TlGA193的基因序列如SEQIDNO：5所示：根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的编码基因序列如SEQIDNO:6所示：根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的编码基因序列如SEQIDNO:7所示：根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA3的编码基因序列如SEQIDNO:8所示：本专利技术提供了包含上述化葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体编码基因的重组载体。本专利技术还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体编码基因的重组菌株，优选的菌株为毕赤酵母GS115，含葡萄糖淀粉酶突变体基因的重组菌株分别为重组赤酵母GS115/GA1，GS115/GA2，GS115/GA3。根据本专利技术的具体实施方式，制备葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体的方法如下所述：(1)用含有葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体表达；(3)回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体。本专利技术的有益效果：葡萄糖淀粉酶突变体GA1的比活力为806U/mg、葡萄糖淀粉酶GA2的比活力为1054U/mg、葡萄糖淀粉酶GA3的比活力为1540U/mg。分别较野生型葡萄糖淀粉酶TlGA1931的比活力496U/mg分别提高：62.5％、112％和210％。在比活方面有较大幅度的提高。70℃处理10min后野生型相对剩余酶活为14％，葡萄糖淀粉酶突变体GA1、GA2、GA3的剩余酶活分别为：70％、90％、86％。75℃处理2min后野生型相对剩余酶活为13％，突变体GA1、GA2、GA3的剩余酶活分别为：80％、95％、80％。且最适温度分别较野生型提高5℃、10℃、10℃。因此，葡萄糖淀粉酶突变体的热稳定获得明显提高。从GA1到GA3，其比活力和热稳定性都有明显提升。本专利技术提供了多个葡萄糖淀粉酶突变体，具有催化效率高、热稳定性好的优良性质，能够完全满足工业应用需求，可以很好的应用于食品、医药、纺织及饲料行业中，有着广阔的应用前景。附图说明图1显示葡萄糖淀粉酶GA1至GA3的70℃热稳定性分析结果；图2显示葡萄糖淀粉酶GA1至GA3的75℃热稳定性分析结果；图3显示葡萄糖淀粉酶GA1至GA3的最适温度的分析结果。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：毕赤酵母(PichiapastorisGS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115。2、酶类及其它生化试剂：连接酶购自Invitrogen公司，定点突变试剂盒购自全式金公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶突变体GA3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。/n

【技术特征摘要】
1.比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶突变体GA3的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。


2.一种制备权利要求1所述比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列的第132位碱基由Ser突变为Cys、第492位碱基由Tyr突变为Cys、第548位碱基由Leu突变为Cys、第562位碱基由Ala突变为Cys，得到葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1，其中，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；
(2)将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的氨基酸序列的第108位碱基由Gln突变为Glu得到葡萄糖淀粉酶突变体GA2；
(3)将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的氨基酸序列的第468、469、470位碱基由Ala、Tyr、Ser突变为Asp和Pro得到葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴吉，王克芬，张杰，佟新伟，刘文龙，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37