黑曲霉LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用，黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112能够产生高酶活性的葡萄糖淀粉酶，利用黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112生产葡萄糖淀粉酶，为葡萄糖淀粉酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现葡萄糖淀粉酶的规模化生产；将具有产高酶活力的葡萄糖淀粉酶的黑曲霉应用到烟叶发酵中，能加速烟叶中淀粉的降解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。

Application of Aspergillus niger lccc30112 in the production of glucoamylase and tobacco fermentation

【技术实现步骤摘要】
黑曲霉LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用
本专利技术涉及黑曲霉LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶烟叶发酵中的应用，属于微生物应用的

技术介绍
葡萄糖淀粉酶能水解淀粉中的α-1.4糖苷键和α-1.6糖苷键，在水解过程中，由底物分子中的非还原端开始，逐步水解出葡萄糖，可以用于烟叶中淀粉的降解。烟叶发酵是在一定的温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化的过程，是卷烟工业提高产品质量的一种初加工方法。对于烟叶的发酵，目前多数采用自然发酵与人工发酵。自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，它的主要特点是在烟叶贮藏期间，利用一年一度的春季温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的。人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法。但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。黑曲霉(Aspergillusniger)属于曲霉属丝状真菌，由于其强大的蛋白分泌能力被广泛应用于发酵工业中，该菌种所产酶类最多，可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、乳糖酶、植酸酶、单宁酶、青霉素、纳他霉素和万古霉素等。FAO/WHO/JECFA等粮食安全专家委员会裁定的食品工业用酶使用菌种有20多种，其中黑曲霉高居第一，是允许使用的安全性生产菌株。现有技术中未见在已有菌株中筛选得到高酶活力的黑曲霉及其应用的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用，黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112能够高产葡萄糖淀粉酶，十分适用于生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵。一方面，本专利技术提供了黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶中的应用，黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112能够产生高酶活性的葡萄糖淀粉酶，为葡萄糖淀粉酶的生产来源提供了一个新的来源。另一方面，本专利技术还提供了一种利用黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112生产葡萄糖淀粉酶的方法，该方法包括将活化的黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112接种于液体培养基中进行发酵培养，发酵液经离心得上清液的步骤。优选的，黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112的接种量为105～107cfu/ml，所述培养为通风培养，通风量为1：0.5～1.5V/V·min，温度为20～40℃，时间为2～4d；优选的，接种量为106cfu/ml，通风量为1：1.0V/V·min，温度为30℃，时间为3d；优选的，所述液体培养基含有：蔗糖2g/L、玉米淀粉4g/L、黄豆粉1g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.05g/L、pH为5.0～6.0，液体培养基的装量为60～80％；优选的，pH为5.5，液体培养基的装量为75％；优选的，所述离心的温度为0～4℃，转速为5000～7000r/min，时间为10～20min；优选的，将黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112在PDA培养基中活化培养2～5d后进行接种；优选的，PDA培养基含有：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L。进一步的，所述方法还包括在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，透析脱盐后，得粗酶的步骤。优选的，硫酸铵的饱和度为75～85％；优选的，硫酸铵的饱和度为80％；优选的，在上清液加入硫酸铵溶解后，7000～9000r/min离心20min～40min,沉淀用去离子水透析；优选的，8000r/min离心30min。进一步的，所述方法还包括将粗酶使用SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱和SephadexG-50凝胶过滤层析柱纯化的步骤。优选的，所述纯化的具体步骤为：(1)将粗酶上样到SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱，使用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速1.5～2.5mL/min，收集活性组分，经去离子水透析，冷冻干燥后，得酶粉；(2)将酶粉用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后，上样到SephadexG-50凝胶过滤层析柱，使用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速1.5～2.5mL/min，收集活性组分，经去离子水透析、冷冻干燥后，得纯化后的酶粉。另一方面，本专利技术还提供了黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112或所述的方法在烟叶发酵中的应用。另一方面，本专利技术还提供了一种烟叶发酵方法，在烟叶中接种黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112进行发酵。优选的，黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112的接种量为105～107cfu/g，发酵的温度为20～40℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。本专利技术的有益效果为：本专利技术公开了黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112能够产生高酶活性的葡萄糖淀粉酶，为葡萄糖淀粉酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现葡萄糖淀粉酶的规模化生产；将具有产高酶活力的葡萄糖淀粉酶的黑曲霉应用到烟叶发酵中，能加速烟叶中淀粉的降解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本专利技术技术方案，实现或使用本专利技术所做的说明，并不以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术中，如未指定，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。本专利技术使用的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株购于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为：LCCC30112。实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。实施例1黑曲霉LCCC30112发酵生产葡萄糖淀粉酶黑曲霉LCCC30112发酵工艺研究经过单因素多水平、多因素多水平等配方试验，确定黑曲霉LCCC30112的液体产酶工艺：将保存菌株转接至活化培养基上，30℃培养3d，备用。活化培养基采用PDA培养基：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L，pH自然，121℃灭菌30min备用。种子液制备：将黑曲霉LCCC30112菌株转接至活化培养基，培养4d至大量产孢，用1％的生理盐水反复洗下孢子，收集孢子悬浮液，接种到种子液培养基中，接种量1％(浓度108cfu/mL)，温度30℃、转速180r/min的条件下培养3d，然后接种到发酵液培养基，接种量为106cfu/mL。发酵液培养基同种子液培养基：蔗糖2g/L、玉米淀粉4g/L、黄豆粉1g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.05g/L，pH5.5。发酵罐培养基灭菌：121℃，60min。接种：利用火焰圈无菌接种，接种量为1％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶中的应用。


2.利用黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112生产葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于，该方法包括将活化的黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112接种于液体培养基中进行发酵培养，发酵液经离心得上清液的步骤。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112的接种量为105～107cfu/ml，所述培养为通风培养，通风量为1：0.5～1.5V/V·min，温度为20～40℃，时间为2～4d；
优选的，接种量为106cfu/ml，通风量为1：1.0V/V·min，温度为30℃，时间为3d；
优选的，所述液体培养基含有：蔗糖2g/L、玉米淀粉4g/L、黄豆粉1g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.05g/L、pH为5.0～6.0，液体培养基的装量为60～80％；
优选的，pH为5.5，液体培养基的装量为75％；
优选的，所述离心的温度为0～4℃，转速为5000～7000r/min，时间为10～20min；
优选的，将黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112在PDA培养基中活化培养2～5d后进行接种；
优选的，PDA培养基含有：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，透析脱盐后，得粗酶的步骤。
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【专利技术属性】
技术研发人员：纪旭东，钟丽娟，王胜利，赵新海，温源，张庆华，赵赛月，王伟华，张宝，王旭东，李力群，乔月梅，
申请(专利权)人：内蒙古昆明卷烟有限责任公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15