热稳定的葡糖淀粉酶及其使用方法技术

公开了具有葡糖淀粉酶活性的多肽、包含此类多肽的组合物、以及应用此类多肽和组合物的方法。

Thermostable glucoamylase and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】热稳定的葡糖淀粉酶及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年3月07日提交的国际专利申请号PCT/CN2013/076419的权益，将该国际申请通过引用以其全文结合在此。
本公开涉及具有葡糖淀粉酶活性的多肽和包含此类多肽的组合物。本公开进一步涉及编码此类多肽的多核苷酸，包含编码此类多肽的基因的载体和宿主细胞，所述载体和宿主细胞也能够产生此类多肽。本公开还涉及使用或应用多肽或组合物糖化含淀粉材料的方法，以及通过所述方法产生的糖类。此外，本公开涉及生产发酵产物的方法以及通过所述方法生产的发酵产物。
技术介绍
葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由若干种丝状真菌和酵母产生。葡糖淀粉酶的主要应用是将部分加工的淀粉/糊精糖化成葡萄糖，葡萄糖是许多发酵过程的必需底物。然后可以使用发酵生物将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程也通常被用于消费醇类(例如，啤酒和白酒)、乳制品(例如，用于生产酸奶和奶酪)、皮革、饮料以及烟草工业中。终产物还可以是糖浆。例如，终产物可以是葡萄糖，而且还可以例如通过葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎相等地葡萄糖和果糖构成的混合物。这种混合物，或进一步富集果糖的混合物，是在世界范围内商业上最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。尽管据报道多种微生物产生葡糖淀粉酶(因为它们在细胞外分泌大量的酶)，但用于商业目的的葡糖淀粉酶传统上使用丝状真菌生产。然而，商业上使用的真菌葡糖淀粉酶具有某些限制因素，例如适度的热稳定性、酸性pH要求、和缓慢的催化活性，这增加了工艺成本。因此，需要寻找新的葡糖淀粉酶以改善温度最佳值，从而改善催化效率以缩短糖化时间或获得更高的终产物产率。本公开的一个目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的某些多肽、编码所述多肽的多核苷酸、可用于产生此类多肽的核酸构建体、包含其的组合物、以及将此类多肽应用于不同工业应用的方法。
技术实现思路
本专利技术的多肽、组合物和使用或应用所述多肽或组合物糖化含淀粉材料的方法。所述多肽、组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。1.在一方面，一种具有葡糖淀粉酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：(a)多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:3的多肽具有至少95％，例如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件、更优选地至少中严格条件、甚至更优选地至少中-高严格条件、最优选地至少高严格条件、以及甚至最优选地至少非常高严格条件下与以下项杂交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；(d)变体，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一个或多个(例如，几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。2.在另一方面，一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如段落1所述的多肽的核苷酸序列。3.在如段落2所述的多核苷酸的一些实施例中，所述多核苷酸有效地连接至控制所述多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。4.在另一方面，一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如段落2所述的多核苷酸。5.在如段落4所述的宿主细胞的一些实施例中，所述宿主细胞是产乙醇微生物。6.在如段落4或5所述的宿主细胞的一些实施例中，所述宿主细胞进一步表达和分泌一种或多种选自下组的另外的酶，该组包含蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、马来酸酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、转移酶、或其组合。7.另一方面，一种用于糖化含淀粉材料的方法，所述方法包括以下步骤：i)使所述含淀粉材料与α-淀粉酶接触；和ii)使所述含淀粉材料与葡糖淀粉酶在至少70℃的温度下接触；其中所述方法从所述含淀粉材料(底物)产生至少70％的游离葡萄糖。8.在如段落7所述方法的一些实施例中，其中步骤(ii)在至少75℃、优选地至少80℃的温度下进行12与96小时之间，优选地进行18至60小时。9.在如段落7或8所述的方法的一些实施例中，其中所述葡糖淀粉酶在至少70℃的温度，和/或在2.0与7.0之间的pH、优选在pH4.0与pH6.0之间、更优选在pH4.5与pH5.5之间，保持至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％的相对活性。10.在如段落7-9中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述方法包括顺序或同时进行步骤(i)和步骤(ii)。11.在如段落7-10中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述方法进一步包括在糖化步骤ii)之前的预糖化。12.在如段落7-11中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述葡糖淀粉酶是如权利要求1所述的多肽。13.在如段落7-12中任一项所述的方法的一些实施例中，其中步骤(i)在所述含淀粉材料的糊化温度或低于糊化温度下进行。14.在如段落7-13中任一项所述的方法的一些实施例中，其中在步骤(i)和/或步骤(ii)中不存在另外的脱支酶。15.在如段落14所述的方法的一些实施例中，其中所述脱支酶是支链淀粉酶。16.另一方面，一种糖，其通过如段落7-15中任一项所述的方法产生。17.另一方面，一种从段落16所述的糖生产发酵产物的方法，其中所述糖通过发酵生物进行发酵。18.在如段落17所述的方法的一些实施例中，其中所述发酵过程与步骤(ii)顺序或同时进行。19.在如段落17或18所述的方法的一些实施例中，其中所述发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有葡糖淀粉酶活性的多肽，所述多肽选自由以下组成的组：/n(a)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:3的多肽具有至少95％，例如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；/n(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件、更优选地至少中严格条件、甚至更优选地至少中-高严格条件、最优选地至少高严格条件、以及甚至最优选地至少非常高严格条件下与以下项杂交/n(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，/n(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或者/n(iii)(i)或(ii)的全长互补链；/n(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；/n(d)变体，所述变体包含SEQ ID NO:3的多肽的一个或多个(例如，几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及/n(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170307 CN PCT/CN2017/0758721.一种具有葡糖淀粉酶活性的多肽，所述多肽选自由以下组成的组：
(a)多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:3的多肽具有至少95％，例如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件、更优选地至少中严格条件、甚至更优选地至少中-高严格条件、最优选地至少高严格条件、以及甚至最优选地至少非常高严格条件下与以下项杂交
(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或者
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；
(d)变体，所述变体包含SEQIDNO:3的多肽的一个或多个(例如，几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。


2.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。


3.一种载体，所述载体包含有效地连接至一个或多个控制序列的如权利要求2所述的多核苷酸，所述控制序列控制所述多肽在表达宿主内的产生。


4.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如权利要求2所述的多核苷酸。


5.如权利要求4所述的宿主细胞，所述宿主细胞是产乙醇微生物。


6.如权利要求4或5所述的宿主细胞，所述宿主细胞进一步表达和分泌一种或多种选自下组的另外的酶，该组包含蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、马来酸酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、转移酶、或其组合。


7.一种用于糖化含淀粉材料的方法，所述方法包括以下步骤：i)使所述含淀粉材料与...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·F·克拉米尔，葛晶，M·A·B·科尔克曼，I·尼古拉耶夫，J·K·舍蒂，唐忠美，W·A·H·范德克雷杰，谢志勇，张波，邹争争，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US