一种DNA环化分子及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种融合蛋白及其用途。本发明专利技术提供一种融合蛋白，包括同源二聚体片段和dCas9蛋白片段，所述同源二聚体片段包括LDB1蛋白片段或LDB1蛋白的Dimer domain片段。本发明专利技术将LDB1与

【技术实现步骤摘要】
一种DNA环化分子及其用途
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种融合蛋白及其用途。
技术介绍
细胞核中染色质的折叠和不同区域的相互作用产生了染色质三维结构，染色质三维结构又在基因表达中扮演关键作用。启动子和增强子序列是调控基因表达的顺式作用元件。启动子是临近基因上游一段DNA区域，能够招募转录因子结合启动基因表达。增强子是位于目标基因上下游一定距离的一段序列，并通过DNA成环与目标基因启动子相互作用而激活或提高目标基因表达。基于不同胚胎发育阶段的研究更详细的描述出在发育过程中增强子和增强子成环的动态变化对基因时空表达的调控。其中研究最深入的是人β-globin基因簇。该基因簇中的远程增强子被称为“基因簇调控区(LCR)”。在发育过程中，LCR通过与不同基因启动子结合成环依次调控表达胚胎的ε-globin(HBE)、婴儿的γ-globin(HBG)、以及成人的δ-globin(HBE)和β-globin(HBB)。因此，人工成环作为一个可行的策略可以被用来研究增强子对内源基因表达的调控，甚至具有运用在疾病治疗中的潜力。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种融合蛋白及其用途，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术一方面提供一种融合蛋白，包括同源二聚体片段和dCas9蛋白片段，所述同源二聚体片段包括LDB1蛋白片段或LDB1蛋白的Dimerdomain片段。在本专利技术一些实施方式中，所述LDB1蛋白片段的氨基酸序列包括：a)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或，b)与SEQIDNO.1具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能，优选为能够形成同源二聚体。在本专利技术一些实施方式中，所述LDB1蛋白的Dimerdomain片段的氨基酸序列包括：c)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或，d)与SEQIDNO.2具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有c)所限定的氨基酸序列的功能，优选为能够形成同源二聚体。在本专利技术一些实施方式中，所述dCas9蛋白片段的氨基酸序列包括：e)如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；或，f)与SEQIDNO.3具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有e)所限定的氨基酸序列的功能，优选为能够特异性靶向位点的sgRNA相配合。在本专利技术一些实施方式中，所述融合蛋白自5’端至3’端依次包括同源二聚体片段和dCas9蛋白片段。在本专利技术一些实施方式中，所述融合蛋白自5’端至3’端依次包括dCas9蛋白片段和同源二聚体片段。在本专利技术一些实施方式中，所述融合蛋白还包括柔性连接肽段，所述柔性连接肽段位于同源二聚体片段和dCas9蛋白片段之间，优选的，所述柔性连接肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.41～42所示。在本专利技术一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.37～40其中之一所示。本专利技术另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述的融合蛋白。本专利技术另一方面提供一种DNA成环体系，包括所述的融合蛋白，还包括靶向启动子的sgRNA和靶向增强子的sgRNA。在本专利技术一些实施方式中，所述靶向启动子的sgRNA靶向基因TSS上游-100至-200bp区间。在本专利技术一些实施方式中，所述靶向启动子的sgRNA具有gnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNGG特征(SEQIDNO.43)。在本专利技术一些实施方式中，所述靶向启动子的GC含量在40-60％之间。在本专利技术一些实施方式中，所述靶向启动子的sgRNA靶向HBB基因的启动子区域，优选的，所述靶向启动子的sgRNA的序列如SEQIDNO.4～6所示。在本专利技术一些实施方式中，所述靶向增强子的sgRNA靶向增强子的DHS区域。在本专利技术一些实施方式中，所述靶向增强子的sgRNA靶向β-globin的LCR区域的DHS2附近。在本专利技术一些实施方式中，所述靶向增强子的sgRNA的序列如SEQIDNO.7～9所示。本专利技术另一方面提供一种表达系统，所述表达系统包括能够表达所述融合蛋白、所述靶向启动子的sgRNA和所述靶向增强子的sgRNA的宿主细胞。在本专利技术一些实施方式中，所述表达系统包括含有编码所述融合蛋白的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞。在本专利技术一些实施方式中，所述表达系统包括含有编码所述靶向启动子的sgRNA的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述靶向启动子的sgRNA的多核苷酸的宿主细胞。在本专利技术一些实施方式中，所述表达系统包括含有编码所述靶向增强子的sgRNA的多核苷酸的表达载体的宿主细胞，或染色体中整合有编码所述靶向增强子的sgRNA的多核苷酸的宿主细胞。在本专利技术一些实施方式中，所述表达系统还包括能够表达目标基因的宿主细胞。在本专利技术一些实施方式中，所述宿主细胞选自真核细胞。在本专利技术一些实施方式中，所述宿主细胞选自后生动物来源的原代细胞或永生化细胞系。在本专利技术一些实施方式中，所述宿主细胞选自血系细胞系。在本专利技术一些实施方式中，所述宿主细胞选自人K562细胞。本专利技术另一方面提供所述的DNA成环分子、所述的多核苷酸、所述的成环体系、所述的表达系统在基因表达中的用途。在本专利技术一些实施方式中，所述基因表达中的用途为真核生物的基因表达中的用途。在本专利技术一些实施方式中，所述真核生物选自后生动物。在本专利技术一些实施方式中，所述真核生物选自人、小鼠、线虫、果蝇中的一种或多种的组合。本专利技术另一方面提供一种基因表达方法，包括：通过所述的融合蛋白、或所述的成环体系，拉近靶向位点的三维空间距离，进行基因表达。在本专利技术一些实施方式中，所述基因表达方法包括：在所述成环体系存在的条件下，在适当条件下培养能够表达目标基因的宿主细胞。在本专利技术一些实施方式中，所述基因表达方法为体外基因表达方法。在本专利技术一些实施方式中，所述基因表达方法包括：在适当条件下培养求所述的表达系统。附图说明图1显示为本专利技术LDB1-dCas9介导的DNA成环对目的基因空间位置重编程的示意图。图2显示为本专利技术LDB1-dCas9与dCas9-LDB1介导DNA成环后β-globin基因簇里各基因表达的变化。图3显示为本专利技术基因簇里其他globin基因的表达情况示意图。图4显示为本专利技术LDB1-dCas9、dCas9-LDB1、dCas9-DD与DD-dCas9激活HBB基因的效率比较。具体实施方式本专利技术专利技术人经过大量探索性研究，提供了一种新型DNA环化分子，所述DNA环化分子包括由LDB1与dCas9所形成的融合蛋白，可以通过重编程基因的空间位置调控基因表达，在此基础上完成了本专利技术。本专利技术第一方面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，包括同源二聚体片段和dCas9蛋白片段，所述同源二聚体片段包括LDB1蛋白片段或LDB1蛋白的Dimer domain片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，包括同源二聚体片段和dCas9蛋白片段，所述同源二聚体片段包括LDB1蛋白片段或LDB1蛋白的Dimerdomain片段。


2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述LDB1蛋白片段的氨基酸序列包括：
a)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或，
b)与SEQIDNO.1具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能，优选为能够形成同源二聚体。


3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述LDB1蛋白的Dimerdomain片段的氨基酸序列包括：
c)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或，
d)与SEQIDNO.2具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有c)所限定的氨基酸序列的功能，优选为能够形成同源二聚体。


4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述dCas9蛋白片段的氨基酸序列包括：
e)如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；或，
f)与SEQIDNO.3具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有e)所限定的氨基酸序列的功能，优选为能够特异性靶向位点的sgRNA相配合。


5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白自5’端至3’端依次包括同源二聚体片段和dCas9蛋白片段；
和/或，所述融合蛋白自5’端至3’端依次包括dCas9蛋白片段和同源二聚体片段；
和/或，所述融合蛋白还包括柔性连接肽段，所述柔性连接肽段位于同源二聚体片段和dCas9蛋白片段之间，优选的，所述柔性连接肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.41～42所示。


6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.37～40其中之一所示。


7.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～6任一权利要求所述的融合蛋白。


8.一种DNA成环体系，包括如权利要求1～6任一权利要求所述的融合蛋白，还包括靶向启动子的sgRNA和靶向增强子的sgRNA。


9.如权利要求8所述的DNA成环体系，其特征在于，所述靶向启动子的sgRNA靶向基因TSS上游-100至-200bp区间；
和/或，所述靶向启动子的sgRNA具有gnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNGG特征；
和/或，所述靶向启动子的GC含量在40...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯松杰，江雯，黄行许，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海;31