一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用，本发明专利技术利用λRed重组酶促进模板DNA与基因组靶位点发生双交换，结合CRISPR/Cas9系统作为筛选手段，结合一步法同源重组快速构建打靶质粒，可实现基因的插入、替换或敲除。本发明专利技术完全根据设计同源模板替换基因组DNA，无其他片段残留。本发明专利技术可在3～4天内高效完成基因组编辑，降低实验强度，缩短实验周期。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用。
技术介绍
沙门氏菌是常见的人畜共患病原菌，是各国细菌性食物感染中最常见的致病菌，能导致胃肠炎、伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种症候群。通过基因组编辑技术改造沙门氏菌基因组，获得不同遗传背景的菌株，有助于研究沙门氏菌生长、繁殖及其致病过程的机制，为预防和治疗奠定基础。减毒沙门氏菌还能够应用于肿瘤治疗，例如，减毒沙门氏菌VNP20009菌株在动物模型上对多种肿瘤有一定的治疗效果。对沙门氏菌基因组进行遗传改造是进一步提升其治疗效果的重要手段，可通过改造沙门氏菌基因组上的侵染、运动或代谢等相关基因，或将治疗基因整合到细菌染色体上稳定表达提高治疗效果，或将报告基因整合到染色体上稳定表达进行体内示踪。基于λ噬菌体的Red同源重组系统是常用的改造细菌基因组的方法，在大肠杆菌[Datsenko,K.A.2000]和沙门氏菌[HusseinyMI等,2005；SolanoC等,2010]中均有应用。利用Red同源重组方法敲除后的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统由双质粒CRISPR/Cas9系统构成，包含表达相关功能蛋白的辅助质粒A及表达靶位点sgRNA的打靶质粒B。/n

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统由双质粒CRISPR/Cas9系统构成，包含表达相关功能蛋白的辅助质粒A及表达靶位点sgRNA的打靶质粒B。


2.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的辅助质粒A包含以下元件的核酸序列：Cas9蛋白、λRed重组酶、温敏型复制子、打靶质粒B复制子的sgRNA表达框和辅助质粒A筛选标记基因，其中重组酶及sgRNA为诱导表达。


3.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的打靶质粒B包含以下元件的核酸序列：复制子、打靶质粒筛选标记基因、靶位点sgRNA表达框以及进行同源重组的DNA片段，所述的辅助质粒A和打靶质粒B所含有的复制子可在大肠杆菌及沙门氏菌中复制，其中质粒B的复制子及筛选标记基因应与质粒A不同，且打靶质粒B不可选用与辅助质粒A不相容的复制子。


4.根据权利要求2或3所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的sgRNA表达框具有启动子-(N)X-sgRNA骨架-终止子结构，所述的靶位点DNA具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示X个N，N为A、T、C或T任一碱基，X为大于15小于25的自然数。


5.根据权利要求4所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的靶位点DNA的X为20，所述的同源重组的DNA片段用于敲入或替换时为上游同源臂-插入片段-下游同源臂，用于敲除时为上游同源臂-下游同源臂，该DNA片段构建在打靶质粒B中或PCR产物中；所述基因编辑系统可同时对多个靶位点进行基因编辑。


6.根据权利要求5所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的打靶质粒B包含多个靶位点的编辑模块，结构为质粒骨架(抗性基因-复制子)-编辑模块1(靶位点1sgRNA表达框-上游同源臂1-敲入(或替换)片段-下游同源臂1)-编辑模块2(靶位点2sgRNA表达框-上游同源臂2-敲入(或替换)片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，李家璜，韩超，王萌慧，周俊杰，李静，
申请(专利权)人：常州南京大学高新技术研究院，江苏靶标生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32