【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于多效应子CRISPR的诊断系统相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月9日提交的美国临时申请No.62/556,408；2017年12月22日提交的美国临时申请No.62/610,121；和2018年2月14日提交的美国临时申请No.62/630,808的权益。上述申请的全部内容通过引用全部并入本文。关于联邦政府资助研究的声明本专利技术是在国立卫生研究院授予的拨款号MH110049的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
本文所公开的主题一般涉及与CRISPR效应系统的使用相关的快速诊断。
技术介绍
核酸是生物信息的通用标志。在便携式平台上以高灵敏度和单碱基特异性快速检测核酸的能力具有彻底改革许多疾病的诊断和监测的潜力，提供有价值的流行病学信息，并作为普遍的科学工具。尽管已经开发了许多用于检测核酸的方法(Du等，2017；Green等，2014；Kumar等，2014；Pardee等，2014；Pardee等，2016；Urdea等，2006)，但它们不可避免地受损于在灵敏度、特异性、简单性和速度之间进行权衡。例如，qPCR方法灵敏但昂贵，并且依赖于复杂仪器，限制了对于在实验室环境中训练有素的操作员的可用性。其他方法，例如将等温核酸扩增与便携式平台相结合的新方法(Du等，2017；Pardee等，2016)，在护理点(POC)环境中提供了高检测特异性，但由于灵敏度低而应用有限。随着核酸诊断变得与各种医疗保健应用越来越相关，在低成本下提供高特异性和灵敏度的检测技术在临床和...
【技术保护点】
1.一种核酸检测系统，其包括：/na)检测CRISPR系统，其包括：/ni.效应蛋白，/nii.一种或多种设计用于结合相应靶分子的指导RNA，和/niii.一种或多种信号放大CRISPR效应蛋白；和/nb)一种或多种基于RNA的掩蔽构建体。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170909 US 62/556,408;20171222 US 62/610,121;20181.一种核酸检测系统，其包括：
a)检测CRISPR系统，其包括：
i.效应蛋白，
ii.一种或多种设计用于结合相应靶分子的指导RNA，和
iii.一种或多种信号放大CRISPR效应蛋白；和
b)一种或多种基于RNA的掩蔽构建体。
2.一种多肽检测系统，其包括：
a)检测CRISPR系统，其包括：
i.效应蛋白，
ii.一种或多种设计用于结合触发RNA的指导RNA，和
iii.一种或多种信号放大CRISPR效应蛋白；
b)一种或多种基于RNA的掩蔽构建体；和
c)一种或多种检测适体，所述检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述一种或多种信号放大CRISPR效应蛋白包括IIIa型CRISPR蛋白。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述III型CRISPR蛋白是Csm6蛋白。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述Csm6蛋白选自EiCsm6和LsCsm6。
6.根据权利要求3所述的系统，其中所述一种或多种信号放大CRISPR效应蛋白包括Csx28或Csx27。
7.根据权利要求3所述的系统，其中所述一种或多种信号放大CRISPR效应蛋白包括Csm6，Csx28，Csx27或其任何组合中的一种或多种。
8.根据权利要求3所述的系统，其还包括核酸扩增试剂。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶分子是靶DNA，并且所述系统还包括结合所述靶DNA且包含RNA聚合酶启动子的引物。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述CRISPR系统效应蛋白是RNA靶向效应蛋白。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述RNA靶向效应蛋白包含一个或多个HEPN结构域。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述一个或多个HEPN结构域包含RxxxxH基序序列。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述RxxxH基序包含R{N/H/K]X1X2X3H序列。
14.根据权利要求13所述的系统，其中X1是R、S、D、E、Q、N、G或Y，并且X2独立地是I、S、T、V或L，并且X3独立地是L、F、N、Y、V、I、S、D、E或A。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述CRISPRRNA靶向效应蛋白是C2c2。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述C2c2是在Cas1基因的20kb内。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述C2c2效应蛋白来自选自以下的属的生物：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta，固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述C2c2或Cas13b效应蛋白来自选自以下的生物：Leptotrichiashahii；Leptotrichiawadei(Lw2)；Listeriaseeligeri；LachnospiraceaebacteriumMA2020；LachnospiraceaebacteriumNK4A179；[梭菌属]aminophilumDSM10710；CarnobacteriumgallinarumDSM4847；CarnobacteriumgallinarumDSM4847(第二CRISPR基因座)；PaludibacterpropionicigenesWB4；ListeriaweihenstephanensisFSLR9-0317；ListeriaceaebacteriumFSLM6-0635；LeptotrichiawadeiF0279；RhodobactercapsulatusSB1003；RhodobactercapsulatusR121；RhodobactercapsulatusDE442；LeptotrichiabuccalisC-1013-b；Herbinixhemicellulosilytica；[真细菌属]rectale；EubacteriaceaebacteriumCHKCI004；Blautiasp.Marseille-P2398；Leptotrichiasp.oraltaxon879str.F0557；LachnospiraceaebacteriumNK4A144；Chloroflexusaggregans；Demequinaaurantiaca；Thalassospirasp.TSL5-1；Pseudobutyrivibriosp.OR37；Butyrivibriosp.YAB3001；Blautiasp.Marseille-P2398；Leptotrichiasp.Marseille-P3007；Bacteroidesihuae；PorphyromonadaceaebacteriumKH3CP3RA；Listeriariparia；和Insolitispirillumperegrinum。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述C2c2效应蛋白是L.wadeiF0279或L.wadeiF0279(Lw2)C2c2效应蛋白。
20.根据权利要求3所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体抑制可检测阳性信号的产生。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体通过掩蔽所述可检测阳性信号或者相反产生可检测阴性信号来抑制可检测阳性信号的产生。
22.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包含抑制由报告构建体编码的基因产物的产生的沉默RNA，其中所述基因产物在表达时产生所述可检测阳性信号。
23.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体是产生所述可检测阴性信号的核酶，并且其中当所述核酶失活时产生所述可检测阳性信号。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述核酶将底物转化为第一颜色，并且其中当所述核酶失活时所述底物转化为第二颜色。
25.根据权利要求20所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽剂是RNA适体和/或包含RNA系连的抑制剂。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述适体或RNA系连的抑制剂螯合酶，其中所述酶通过作用于底物而在从所述适体或RNA系连的抑制剂释放后产生可检测信号。
27.根据权利要求25所述的系统，其中所述适体是抑制酶并阻止所述酶催化从底物产生可检测信号的抑制性适体，或者其中所述RNA系连的抑制剂抑制酶并阻止所述酶催化从底物产生可检测信号。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述酶是凝血酶、蛋白C、中性粒细胞弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或小牛碱性磷酸酶。
29.根据权利要求28所述的系统，其中所述酶是凝血酶，并且所述底物是与用于凝血酶的肽底物共价连接的对硝基苯胺，或与用于凝血酶的肽底物共价连接的7-氨基-4-甲基香豆素。
30.根据权利要求25所述的系统，其中所述适体鳌合一对试剂，所述试剂当从所述适体释放时组合以产生可检测信号。
31.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包含可检测配体和掩蔽组分两者附着至其上的RNA寡核苷酸。
32.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包含通过桥分子聚集的纳米颗粒，其中所述桥分子的至少一部分包含RNA，并且其中当所述纳米颗粒在溶液中分布时所述溶液经历颜色偏移。
33.根据权利要求32所述的系统，其中所述纳米颗粒是胶体金属。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述胶体金属是胶体金。
35.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包含通过连接分子与一个或多个猝灭分子连接的量子点，其中所述连接分子的至少一部分包含RNA。
36.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包含与插入剂复合的RNA，其中所述插入剂在所述RNA的切割后改变吸光度。
37.根据权利要求36所述的系统，其中所述插入剂是吡罗红-Y或亚甲蓝。
38.根据权利要求20所述的系统，其中所述可检测配体是荧光团，并且所述掩蔽组分是猝灭分子。
39.根据权利要求3所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体可以被所述CRISPRRNA靶向效应蛋白和IIIa型CRISPR蛋白切割。
40.根据权利要求39所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包括可以被所述CRISPRRNA靶向效应蛋白切割的基于RNA的掩蔽构建体。
41.根据权利要求40所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包括可以被所述IIIa型CRISPR蛋白切割的基于RNA的掩蔽构建体。
42.根据权利要求40所述的系统，其中所述一种或多种基于RNA的掩蔽构建体包括可以被所述CRISPRRNA靶向效应蛋白切割的一种基于RNA的掩蔽构建体和可以被所述IIIa型CRISPR蛋白切割的一种基于RNA的掩蔽构建体。
43.根据权利要求42所述的系统，其中可以被所述IIIa型CRISPR蛋白切割的所述基于RNA的掩蔽构建体包含均聚物A或C-RNA。
44.根据权利要求3所述的系统，其中所述一种或多种设计用于结合相应靶分子的指导RNA包含(合成)错配。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述错配是所述靶分子中SNP或其他单核苷酸变异的上游或下游。
46.根据权利要求3所述的系统，其中所述一种或多种指导RNA被设计用于检测靶RNA或DNA中的单核苷酸多态性，或RNA转录物的剪接变体。
47.根据权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种指导RNA被设计用于检测当被所述CRISPRRNA靶向效应蛋白切割时产生含有2'3'环状磷酸酯末端的六腺苷酸的靶分子或触发RNA。
48.根据权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种指导RNA被设计用于检测包含聚A段的靶分子或触发RNA。
49.根据权利要求3所述的系统，其中所述一种或多种指导RNA被设计用于结合一种或多种疾病状态诊断性靶分子。
50.根据权利要求49所述的系统，其中所述疾病状态是癌症。
51.根据权利要求50所述的系统，其中所述疾病状态是自身免疫疾病。
52.根据权利要求49所述的系统，其中所述疾病状态是感染。
53.根据权利要求52所述的系统，其中所述感染是由病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫引起。
54.根据权利要求53所述的系统，其中所述感染是病毒感染。
55.根据权利要求54所述的系统，其中所述病毒感染是由DNA病毒引起。
56.根据权利要求55所述的系统，其中所述DNA病毒是肌病毒科、短尾病毒科、长尾病毒科、异疱疹病毒科、疱疹病毒科(包括人类疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒)、Malocoherpesviridae、脂毛病毒科、小杆状病毒科、腺病毒科、Ampullaviridae、囊泡病毒科、非洲猪瘟病毒科(包括非洲猪瘟病毒)、杆状病毒科、Cicaudaviridae、Clavaviridae，覆盖病毒科、小纺锤形病毒科、球状病毒科、Guttaviridae、Hytrosaviridae、虹彩病毒科、Maseilleviridae、Mimiviridae、Nudiviridae、Nimaviridae、Pandoraviridae、Papillomaviridae、Phycodnaviridae、Plasmaviridae、Polydnaviruses、Polyomaviridae(包括猿猴病毒40、JC病毒、BK病毒)、痘病毒科(包括牛痘和天花)、Sphaerolipoviridae、复层病毒科、Turriviridae、Dinodnavirus、盐末端蛋白病毒属、Rhizidovirus。
57.根据权利要求54所述的系统，其中所述病毒感染由双链RNA病毒、正义RNA病毒、负义RNA病毒、逆转录病毒或其组合引起。
58.根据权利要求57所述的系统，其中所述病毒感染由冠状病毒科病毒、小核糖核酸病毒科病毒、杯状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·张，J·戈滕贝格，O·阿布达耶，
申请(专利权)人：博德研究所，麻省理工学院，哈佛学院院长等，
类型：发明
国别省市：美国;US
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