用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物技术方案

本公开提供了用于靶向和编辑核酸的系统、方法和组合物。特别地，本发明专利技术提供了非天然存在的或工程化的RNA靶向系统，所述系统包含靶向RNA的Cas13蛋白、至少一种指导分子和至少一种腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,669的权益。以上确认的申请的全部内容特此以引用方式完全并入本文。关于联邦资助研究的声明本专利技术是根据由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号MH110049在政府支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。电子序列表引用电子序列表(“BROD-2305WP_ST25.txt”；大小为1,409,943字节，创建日期为2018年9月14日)的内容以引用方式整体并入本文。
本专利技术总体上涉及用于靶向和编辑核酸，特别地用于目标靶基因座处腺嘌呤的可编程脱氨的系统、方法和组合物。
技术介绍
在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术是通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的系统性逆向工程化成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用所需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指、转录激活因子样效应子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homingmeganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要采用新颖的策略和分子机制且是负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程化技术。这将为基因组工程化和生物技术的新应用提供主要资源。先前已经报道了胞嘧啶的可编程脱氨，其可用于校正A→G和T→C点突变。例如，Komor等人,Nature(2016)533:420-424报道了在非靶向DNA链中通过APOBEC1胞嘧啶脱氨酶进行的胞嘧啶脱氨，Cas9-指导RNA复合物与靶向DNA链的结合导致该非靶向DNA移位，从而使得胞嘧啶转化为尿嘧啶。另参见Kim等人,NatureBiotechnology(2017)35:371-376；Shimatani等人,NatureBiotechnology(2017)doi:10.1038/nbt.3833；Zong等人,NatureBiotechnology(2017)doi:10.1038/nbt.3811；YangNatureCommunication(2016)doi:10.1038/ncomms13330。
技术实现思路
在一方面，本公开包括一种工程化的非天然存在的系统，所述系统包含无催化活性的Cas13效应蛋白(dCas13)或编码所述无催化活性的Cas13效应蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述dCas13蛋白在C端、N端或这两端处被截短。在一些实施方案中，所述dCas13在所述C端上被截短至少20个、至少40个、至少60个、至少80个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少220个、至少240个、至少260个或至少300个氨基酸。在一些实施方案中，所述dCas13在所述N端上被截短至少20个、至少40个、至少60个、至少80个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少220个、至少240个、至少260个或至少300个氨基酸。在一些实施方案中，所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在C端Δ984-1090、C端Δ1026-1090、C端Δ1053-1090、C端Δ934-1090、C端Δ884-1090、C端Δ834-1090、C端Δ784-1090或C端Δ734-1090处被截短，其中所述截短的氨基酸位置对应于普雷沃氏菌属种P5-125Cas13b蛋白的氨基酸位置。在一些实施方案中，所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在C端Δ795-1095处被截短，其中所述截短的氨基酸位置对应于鸭疫里默氏杆菌Cas13b蛋白的氨基酸位置。在一些实施方案中，所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在C端Δ875-1175、C端Δ895-1175、C端Δ915-1175、C端Δ935-1175、C端Δ955-1175、C端Δ975-1175、C端Δ995-1175、C端Δ1015-1175、C端Δ1035-1175、C端Δ1055-1175、C端Δ1075-1175、C端Δ1095-1175、C-端Δ1115-1175、C-端Δ1135-1175、C-端Δ1155-1175处被截短，其中氨基酸位置对应于咽喉卟啉单胞菌Cas13b蛋白的氨基酸位置。在一些实施方案中，所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在N端Δ1-125、N端Δ1-88或N端Δ1-72处被截短，其中所述截短的氨基酸位置对应于普雷沃氏菌属种P5-125Cas13b蛋白的氨基酸位置。在一些实施方案中，所述dCas13在所述Cas13效应蛋白的HEPN结构域处包含Cas13效应蛋白的截短形式。在一些实施方案中，所述Cas13效应蛋白是Cas13a。在一些实施方案中，所述Cas13效应蛋白是Cas13b。在一些实施方案中，所述Cas13效应蛋白是Cas13c或Cas13d。在一些实施方案中，所述系统还包含功能组分，或者其中所述核苷酸序列还编码所述功能组分。在一些实施方案中，所述功能组分是碱基编辑组分。在一些实施方案中，所述碱基编辑组分包括腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶或它们的催化结构域。在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶、所述胞苷脱氨酶或所述它们的催化结构域融合至所述dCas13。在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶、所述胞苷脱氨酶或所述它们的催化结构域通过接头融合至所述dCas13。在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶、所述胞苷脱氨酶或所述它们的催化结构域插入到所述dCas13的内环中。在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶、所述胞苷脱氨酶或所述它们的催化结构域连接至衔接蛋白。在一些实施方案中，所述衔接蛋白选自MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s和PRR1。在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶、所述胞苷脱氨酶或所述它们的催化结构域是人类、头足类动物或果蝇蛋白。在一些实施方案中，所述dCas13是裂解Cas13效应蛋白。在一些实施方案中，所述裂解Cas13效应蛋白是第一裂解Cas13效应蛋白，并且能够融合至第二裂解Cas13效应蛋白以形成催化活性Cas13效应蛋白。在一些实施方案中，所述第一Cas13效应蛋白和所述第二Cas13效应蛋白的融合是可诱导的。在一些实施方案中，所述功能组分是转录因子或其活性结构域。在一些实施方案中，所述dCas13与所述转录因子或其活性结构域融合。在一些实施方案中，所述系统还包含指导序列。在另一方面，本公开包括一种载体系统，所述载体系统包含一种或多种编码本文所公开的dCas13的载体。在另一方面，本公开包括包含本文所公开的系统本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化的非天然存在的系统，所述系统包含无催化活性的Cas13效应蛋白(dCas13)或编码所述无催化活性的Cas13效应蛋白的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170921 US 62/561,6691.一种工程化的非天然存在的系统，所述系统包含无催化活性的Cas13效应蛋白(dCas13)或编码所述无催化活性的Cas13效应蛋白的核苷酸序列。


2.如权利要求1所述的系统，其中所述dCas13蛋白在C端、N端或这两端处被截短。


3.如权利要求2所述的系统，其中所述dCas13在所述C端上被截短至少20个、至少40个、至少60个、至少80个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少220个、至少240个、至少260个或至少300个氨基酸。


4.如权利要求2所述的系统，其中所述dCas13在所述N端上被截短至少20个、至少40个、至少60个、至少80个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少220个、至少240个、至少260个或至少300个氨基酸。


5.如权利要求2所述的系统，其中所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在C端Δ984-1090、C端Δ1026-1090、C端Δ1053-1090、C端Δ934-1090、C端Δ884-1090、C端Δ834-1090、C端Δ784-1090或C端Δ734-1090处被截短，其中所述截短的氨基酸位置对应于普雷沃氏菌属种P5-125Cas13b蛋白的氨基酸位置。


6.如权利要求2所述的系统，其中所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在C端Δ795-1095处被截短，其中所述截短的氨基酸位置对应于鸭疫里默氏杆菌Cas13b蛋白的氨基酸位置。


7.如权利要求2所述的系统，其中所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在C端Δ875-1175、C端Δ895-1175、C端Δ915-1175、C端Δ935-1175、C端Δ955-1175、C端Δ975-1175、C端Δ995-1175、C端Δ1015-1175、C端Δ1035-1175、C端Δ1055-1175、C端Δ1075-1175、C端Δ1095-1175、C-端Δ1115-1175、C-端Δ1135-1175、C-端Δ1155-1175处被截短，其中氨基酸位置对应于咽喉卟啉单胞菌Cas13b蛋白的氨基酸位置。


8.如权利要求2所述的系统，其中所述Cas13效应蛋白的所述截短形式已在N端Δ1-125、N端Δ1-88或N端Δ1-72处被截短，其中所述截短的氨基酸位置对应于普雷沃氏菌属种P5-125Cas13b蛋白的氨基酸位置。


9.如权利要求1所述的系统，其中所述dCas13在所述Cas13效应蛋白的HEPN结构域处包含Cas13效应蛋白的截短形式。


10.如权利要求1所述的系统，其中所述Cas13效应蛋白是Cas13a。


11.如权利要求1所述的系统，其中所述Cas13效应蛋白是Cas13b。


12.如权利要求1所述的系统，其中所述Cas13效应蛋白是Cas13c或Cas13d。


13.如权利要求1所述的系统，所述系统还包含功能组分，或者其中所述核苷酸序列还编码所述功能组分。


14.如权利要求13所述的系统，其中所述功能组分是碱基编辑组分。


15.如权利要求14所...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·张，J·戈滕贝格，D·B·T·科克斯，O·阿布达耶，S·坎南，
申请(专利权)人：博德研究所，麻省理工学院，哈佛学院院长等，
类型：发明
国别省市：美国;US