一种新型鹅星状病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种新型鹅星状病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法，即将含新型鹅星状病毒Cap蛋白基因的重组PVAX1‑Cap质粒与新型鹅星状病毒mCap蛋白按一定比例混合后与白油佐剂乳化制备复合疫苗，三免后7～150日所采集鸡蛋的平均抗体效价达1:64以上，最高抗体效价可达1:1024。高免蛋提取纯化制备的卵黄抗体产品可对感染新型鹅星状病毒的鹅群提供完全保护。本发明专利技术方法制备的新型鹅星状病毒卵黄抗体效果确实、成本低廉，具有显著的经济与社会效益。

【技术实现步骤摘要】
一种新型鹅星状病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种新型鹅星状病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法。
技术介绍
星状病毒(astrovirus，AstV)是一种无囊膜的、单链正义RNA病毒，直径约为35nm。星状病毒包含三个开放阅读框(ORF)，其中ORF1编码包括蛋白酶(ORF1a)和RNA依赖型RNA聚合酶(ORF1b)在内的非结构蛋白。ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap蛋白，是基因组中的高变区域，特别是ORF2的3’端的Splike区，含有星状病毒的多个中和抗体表位，常作为疫苗开发的靶蛋白。自2017年2月份以来，我国山东、江苏、安徽、河南、辽宁、广东等主要养鹅地区暴发了一种以痛风为主要特征的急性传染病。该病主要侵害2周龄以内的雏鹅，病鹅内脏器官表面和关节腔内有大量的尿酸盐沉积，死亡率最高可达50％，给我国养鹅业造成了巨大的经济损失。后经病毒分离、鉴定以及动物回归试验，确定是感染了一种新型鹅星状病毒。作为一种新发疫病，养鹅业亟需合法的疫苗与特效治疗药物。卵黄抗体产品常作为特效药物用于疫病的紧急预防和治疗。卵黄抗体的制备工艺中，优选免疫原性突出的免疫抗原，使其最大化的刺激蛋鸡的细胞免疫与体液免疫水平，获得抗体滴度高、持续时间长的高免鸡蛋，对降低卵黄抗体的生产成本具有显著经济价值。唐熠等(专利申请号：CN201810494058.4)、常娓娓等(专利申请号：CN201810941620.3)、宋扬等(专利申请号：CN201811315086.1)报道了一些新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，但这些方法均采用鹅胚培养的新型鹅星状病毒作为免疫用抗原，病毒生产效价低，且易引入其他鹅源病原，同时制备的高免鸡蛋效价也相对较低，影响了卵黄抗体的生产效率与产品质量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型鹅星状病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法。该制备方法优选的新型鹅星状病毒复合疫苗免疫蛋鸡后可显著提高蛋黄中新型鹅星状病毒抗体效价，提取纯化制备的卵黄抗体性质稳定、纯度高，可大大降低新型鹅星状病毒卵黄抗体的生产成本，对新型鹅星状病毒病的预防及治疗极具应用价值。根据GenBank中鹅星状病毒Cap蛋白的氨基酸序列，设计一种新型鹅星状病毒Cap蛋白，氨基酸序列为SEQIDNO:1。进一步根据密码子使用偏好性，设计获得新型鹅星状病毒Cap蛋白基因，其中一种核苷酸序列为SEQIDNO:2。制备一种重组PVAX1-Cap质粒，其是由上述获得的新型鹅星状病毒Cap蛋白基因与真核表达载体PVAX1通过酶切连接而成。该重组PVAX1-Cap质粒转化大肠杆菌DH5α后经发酵、DNA提取纯化等步骤进行大量制备。选取新型鹅星状病毒Cap蛋白3’端富含中和抗体表位的Spike功能区，命名为新型鹅星状病毒mCap蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:3。将新型鹅星状病毒mCap蛋白进行大肠杆菌稀有密码子优化，获得的一种新型鹅星状病毒mCap蛋白核苷酸序列SEQIDNO:4。将新型鹅星状病毒mCap蛋白基因与表达载体pET28a连接并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)后进行高密度发酵、菌体破碎、蛋白纯化等步骤进行新型鹅星状病毒mCap蛋白的大量制备。将重组PVAX1-Cap质粒与新型鹅星状病毒mCap蛋白混合制备水相。优选的水相中重组质粒终浓度是20～100μg/ml，重组mCap蛋白终浓度为0.2～0.8mg/ml。更优选的水相中重组质粒终浓度是60μg/ml，重组mCap蛋白终浓度为0.5mg/ml。将水相与白油佐剂乳化制备成新型鹅星状病毒复合疫苗。将高免蛋经过蛋黄分离、灭活、萃取、过滤、分装等步骤，制备卵黄抗体成品，终产品抗体琼扩效价达1:16。本专利技术的制备的新型鹅星状病毒复合疫苗三次免疫蛋鸡，三免后7日所产鸡蛋的抗体效价达到1:128，免疫期中鸡蛋抗体效价最高可达1:1024，三免后5个月依然可达1:64，符合高免蛋要求。与常规制备方法相比本专利技术方法可将高免蛋抗体效价提高4倍以上，从而大大降低新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备成本，极具推广与应用价值。制备的新型鹅星状病毒卵黄抗体用于新型鹅星状病毒病的预防或治疗，均取得优异效果，注射抗体的鹅群获得完全保护。具体实施方式下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的技术方案的情况下可以对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本专利技术保护范围内。实施例1重组PVAX1-Cap质粒的构建与制备1重组PVAX1-Cap质粒的载体构建1.1将GenBank中的鹅星状病毒Cap蛋白的氨基酸序列进行同源比对，并导入在线MOSAIC疫苗设计软件筛选更多潜在9-mer表位覆盖的Cap蛋白，最终获得一种新型鹅星状病毒Cap蛋白，氨基酸序列为SEQIDNO:1。1.2根据鸡的密码子使用偏好性，设计获得新型鹅星状病毒Cap蛋白基因，其中一种核苷酸序列为SEQIDNO:2。1.3将获得的新型鹅星状病毒Cap蛋白基因两端分别加上KpnI和XhoI酶切位点后进行全基因合成。1.4合成的新型鹅星状病毒Cap蛋白基因用KpnI和XhoI双酶切后连入PVAX1载体相应的酶切位点，CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，提取质粒进行KpnI和XhoI双酶切鉴定，正确后送上海生工测序，测序结果表明新型鹅星状病毒Cap蛋白基因连入PVAX1载体相应酶切位点，成功构建重组组PVAX1-Cap质粒。2重组PVAX1-Cap质粒的体外表达与鉴定2.1选取生长良好的PK-15细胞接种6孔细胞培养板，37℃、5％二氧化碳培养箱培养至细胞85％～90％汇合度时，进行重组PVAX1-Cap质粒转染。2.2细胞转染操作按LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行，步骤如下：2.2.1取4μg重组PVAX1-Cap质粒DNA，用无血清细胞培养基稀释至250μl，轻轻混匀。2.2.2取10μl的Lipo2000，用无血清细胞培养基稀释至250μl，轻轻混匀，室温静置5min。2.2.3将DNA悬液和Lipo2000悬液混合后轻轻混匀，室温静置20min。2.2.4将PK-15细胞已长好的6孔板中培养液弃掉，无血清细胞培养液洗2次，吸弃培养液，加入上述混合液，轻轻混匀后，补加1ml无血清细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。2.2.5转染6h后，弃掉6孔板细胞液，每孔加入2ml含10％新生牛血清的DMEM培养基。2.2.6设转染pVAX1空载体的PK-15细胞做为阴性对照。2.3转染48小时后，用pH7.2的PBS液洗涤接毒后细胞板1遍，注意动作轻缓，防止细胞脱落，预冷的甲醇4℃固定细胞15～20min，PBS洗3遍，加入兔抗鹅星状病毒阳性血清100μl，37℃孵育1h，PBS洗3遍，加入100倍稀释的FITC标记羊抗兔二抗1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组PVAX1-Cap质粒，由新型鹅星状病毒Cap蛋白基因与真核表达载体PVAX1通过酶切连接而成，所述的新型鹅星状病毒Cap蛋白的编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述的新型鹅星状病毒Cap蛋白的编码蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组PVAX1-Cap质粒，由新型鹅星状病毒Cap蛋白基因与真核表达载体PVAX1通过酶切连接而成，所述的新型鹅星状病毒Cap蛋白的编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1，所述的新型鹅星状病毒Cap蛋白的编码蛋白的一种核苷酸序列为SEQIDNO:2。


2.权利要求1所述的重组PVAX1-Cap质粒的大量制备方法，将所述的重组PVAX1-Cap质粒转化大肠杆菌DH5α后进行大肠杆菌高密度发酵、菌体裂解、质粒DNA提取纯化制备而成。


3.一种新型鹅星状病毒复合疫苗，复合疫苗由水相与佐剂制备而成，其中，水相中抗原由权利要求1-2所述的重组PVAX1-Cap质粒与重组新型鹅星状病毒mCap蛋白混合而成，所述重组新型鹅星状病毒mCap蛋白的编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:3，所述重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀云，王宏华，焦绪娜，张勇，王辉，刘磊，李佳礼，辛瑞祥，
申请(专利权)人：潍坊华英生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37