基于反向扩增全长质粒和In-fusion连接的快速克隆方法技术

本发明专利技术提供了一种快速克隆方法，包括以下步骤：设计用于扩增目的基因的第一引物对和用于扩增载体模板的第二引物对；其中，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物包括末端重叠序列A，第一下游引物包括末端重叠序列B；所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物包括末端重叠序列B’，第一下游引物包括末端重叠序列A’，且所述末端重叠序列A与所述末端重叠序列A’反向互补，所述末端重叠序列B与所述末端重叠序列B’反向互补；采用PCR反向扩增技术扩增线性化载体以及目的基因；采用连接酶将所述线性化载体与所述目的基因连接，得到环状克隆载体；将所述环状克隆载体导入宿主细胞，进行表达。

A rapid cloning method based on reverse amplification of full-length plasmid and in fusion linkage

【技术实现步骤摘要】
基于反向扩增全长质粒和In-fusion连接的快速克隆方法
本专利技术属于生物技术，尤其涉及一种基于反向扩增全长质粒和In-fusion连接的快速克隆方法。
技术介绍
传统的基因克隆技术始于70年代初期，包括一系列技术，主要包括载体选择、目的DNA片段的获得、体外重组、导入受体细胞及阳性克隆筛选等步骤。该技术实施过程中需要根据载体选择合适的酶切位点，根据已知序列设计相应的引物，从基因组DNA或cDNA中通过聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)获得目的基因，并使得载体与目的基因用相同的限制性内切酶酶切后，在体外通过T4DNA连接酶的作用形成重组体，继而因载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，获得大量同一的重组DNA分子，最后通过PCR或者限制性内切酶酶切法等手段鉴定目的基因大小，获得的阳性克隆经基因测序分析，最终确认目的基因。近年来，随着分子生物学的飞速发展，诸多公司发展了一系列商业性克隆手段，如由Invitr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：/n设计用于扩增目的基因的第一引物对和用于扩增载体模板的第二引物对；其中，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物包括末端重叠序列A，第一下游引物包括末端重叠序列B；所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物包括末端重叠序列B’，第一下游引物包括末端重叠序列A’，且所述末端重叠序列A与所述末端重叠序列A’反向互补，所述末端重叠序列B与所述末端重叠序列B’反向互补；/n提供原始载体模板，采用PCR反向扩增技术扩增含有末端重叠序列A和末端重叠序列B的线性化载体，以及采用PCR反向扩增技术扩增含有末端重叠序列A’和末端...

【技术特征摘要】
1.一种快速克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
设计用于扩增目的基因的第一引物对和用于扩增载体模板的第二引物对；其中，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物包括末端重叠序列A，第一下游引物包括末端重叠序列B；所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物包括末端重叠序列B’，第一下游引物包括末端重叠序列A’，且所述末端重叠序列A与所述末端重叠序列A’反向互补，所述末端重叠序列B与所述末端重叠序列B’反向互补；
提供原始载体模板，采用PCR反向扩增技术扩增含有末端重叠序列A和末端重叠序列B的线性化载体，以及采用PCR反向扩增技术扩增含有末端重叠序列A’和末端重叠序列B’的目的基因；
采用连接酶将所述线性化载体的末端重叠序列A和所述目的基因的末端重叠序列A’连接，将所述线性化载体的末端重叠序列B和所述目的基因的末端重叠序列B’连接，得到环状克隆载体；
将所述环状克隆载体导入宿主细胞，进行表达。


2.如权利要求1所述的快速克隆方法，其特征在于，所述末端重叠序列A含有至少15bp；和/或
所述末端重叠序列B含有至少15bp。


3.如权利要求1所述的快速克隆方法，其特征在于，采用PCR反向扩增技术扩增含有末端重叠序列A和末端重叠序列B的线性化载体的步骤中，在PCR反向扩增结束后，采用DpnⅠ酶消化去除甲基化保护...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宗文，袁静，罗擎颖，赵江林，卫小元，苏少博，刘宇光，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44