一种新的质粒载体构建方法技术

本发明专利技术公开了一种新的质粒载体构建方法。本发明专利技术首先公开了利用CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cas9构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法；进一步公开了包括crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白的成套试剂。本发明专利技术利用crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白替代限制性内切酶对载体进行线性化，得到线性化载体；运用PCR方法得到两端含同源臂的插入片段，该两端同源臂分别与所述线性化载体两端序列同源；运用同源重组克隆的方法将插入片段重组到线性化载体上，最终构建得到新的载体，整个构建过程中未使用任何限制性内切酶及连接酶，构建方法方便、灵活、通用、简单、高效。

A new construction method of plasmid vector

【技术实现步骤摘要】
一种新的质粒载体构建方法
本专利技术涉及生物
具体涉及一种新的质粒载体构建方法，特别涉及采用CRISPR系统构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法。
技术介绍
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(TypeI)、第二型(TypeII)及第三型(TypeIII)。二型限制性内切酶由于其识别和切割位点相重叠或相邻近，其识别位点常被加入到质粒载体中，形成多克隆位点MCS，因此在构建载体时，限制性内切酶常被用在各种质粒载体的线性化和载体构建中。几乎所有载体的构建都要用到限制性内切酶。限制性内切酶的使用方便了质粒载体的构建过程，但是受限于其识别位点的种类，无法实现质粒载体的随意改造，并且插入序列后会存在识别序列残留，无法实现无缝插入。现有最常用的质粒载体构建方法有两种，一种为酶切连接方法，即限制性内切酶酶切载体和插入片段，再利用T4DNA连接酶进行连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法，其特征在于：所述方法为CRISPR/Cpf1法或CRISPR/Cas9法；/n其中，所述CRISPR/Cpf1法包括如下步骤：/n1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cpf1蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM；/n2)以所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列为靶点序列制备crRNA；/n3)利用所述crRNA与Cpf1蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；/n4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有...

【技术特征摘要】
1.构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法，其特征在于：所述方法为CRISPR/Cpf1法或CRISPR/Cas9法；
其中，所述CRISPR/Cpf1法包括如下步骤：
1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cpf1蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM；
2)以所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列为靶点序列制备crRNA；
3)利用所述crRNA与Cpf1蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；
4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体；
所述CRISPR/Cas9法包括如下步骤：
1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cas9蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cas9蛋白识别的PAM序列命名为Cas9-PAM；
2)以所述骨架载体中所述Cas9-PAM的上游DNA序列为靶点序列制备gRNA；
3)利用所述gRNA与Cas9蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；
4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cpf1-PAM的下游DNA序列的长度为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，王德华，王磊，程锐，曾为俊，马翔，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32