一种新的质粒载体构建方法技术

本发明专利技术公开了一种新的质粒载体构建方法。本发明专利技术首先公开了利用CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cas9构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法；进一步公开了包括crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白的成套试剂。本发明专利技术利用crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白替代限制性内切酶对载体进行线性化，得到线性化载体；运用PCR方法得到两端含同源臂的插入片段，该两端同源臂分别与所述线性化载体两端序列同源；运用同源重组克隆的方法将插入片段重组到线性化载体上，最终构建得到新的载体，整个构建过程中未使用任何限制性内切酶及连接酶，构建方法方便、灵活、通用、简单、高效。

A new construction method of plasmid vector

【技术实现步骤摘要】
一种新的质粒载体构建方法
本专利技术涉及生物
具体涉及一种新的质粒载体构建方法，特别涉及采用CRISPR系统构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法。
技术介绍
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(TypeI)、第二型(TypeII)及第三型(TypeIII)。二型限制性内切酶由于其识别和切割位点相重叠或相邻近，其识别位点常被加入到质粒载体中，形成多克隆位点MCS，因此在构建载体时，限制性内切酶常被用在各种质粒载体的线性化和载体构建中。几乎所有载体的构建都要用到限制性内切酶。限制性内切酶的使用方便了质粒载体的构建过程，但是受限于其识别位点的种类，无法实现质粒载体的随意改造，并且插入序列后会存在识别序列残留，无法实现无缝插入。现有最常用的质粒载体构建方法有两种，一种为酶切连接方法，即限制性内切酶酶切载体和插入片段，再利用T4DNA连接酶进行连接，然后转化，抗性筛选和鉴定得到阳性克隆；另一种为同源重组克隆方法，即利用限制性内切酶酶切载体，同时在插入片段的PCR产物两侧引入载体上酶切位点两侧的同源序列，然后利用重组酶实现载体片段与插入片段间的体外重组，通过转化(有缺口的重组克隆会在大肠杆菌内得到修复)，抗性筛选和鉴定得到阳性克隆。但是以上两种方法都受限于限制性内切酶和其识别位点，使质粒载体构建仅能在限制性内切酶识别位点处进行，且改造后质粒载体保留有多余的限制性内切酶识别序列。CRISPR系统在2013年最早被运用到哺乳动物基因编辑中，其依靠一种引导RNA来引导Cas或其他种类的DNA切割蛋白，引导RNA可识别特定的DNA序列并引起其双链断裂。不同的引导RNA可识别不同靶点，在哺乳动物基因组实现特异性识别和断裂，完成基因编辑。但是迄今为止，鲜有关于利用CRISPR系统进行载体构建的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为找到一种能替代限制性内切酶的方法以实现含有外源DNA分子的无缝重组载体的构建。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了利用CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cas9构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法。本专利技术方法为CRISPR/Cpf1法或CRISPR/Cas9法；所述CRISPR/Cpf1法包括如下步骤：1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cpf1蛋白识别的PAM序列的载体(克隆载体或表达载体)，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM；2)以所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列为靶点序列制备CRISPRRNA(crRNA)；3)利用所述crRNA与Cpf1蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法得到含有外源目的DNA分子的重组载体；所述CRISPR/Cas9法包括如下步骤：1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cas9蛋白识别的PAM序列的载体(克隆载体或表达载体)，所述Cas9蛋白识别的PAM序列命名为Cas9-PAM；2)以所述骨架载体中所述Cas9-PAM的上游DNA序列为靶点序列制备guideRNA(gRNA)；3)利用所述gRNA与Cas9蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法得到含有外源目的DNA分子的重组载体。上述方法中，所述Cpf1-PAM为5′-YTN-3′；所述Cas9-PAM为5′-NGG-3′；其中，Y代表T或C，N代表A，T，G或C。上述方法中，所述Cpf1-PAM的下游DNA序列与所述Cpf1-PAM间隔0个碱基；所述Cas9-PAM的上游DNA序列与所述Cas9-PAM间隔0个碱基。上述方法中，所述Cpf1-PAM的下游DNA序列的长度可为17-30bp；所述Cas9-PAM的上游DNA序列的长度可为17-30bp。本专利技术进一步提供了一种成套试剂。本专利技术所述成套试剂为试剂A或试剂B；所述试剂A包括crRNA和Cpf1蛋白；所述试剂B包括gRNA和Cas9蛋白。本专利技术所述成套试剂中所述试剂A还包括骨架载体A，所述骨架载体A上含有Cpf1蛋白的PAM序列，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM，所述crRNA与所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列特异性结合；所述成套试剂中所述试剂B还包括骨架载体B，所述骨架载体B上含有Cas9蛋白的PAM序列，所述Cas9蛋白识别的PAM序列命名为Cas9-PAM，所述gRNA与所述骨架载体中所述Cas9-PAM的上游DNA序列特异性结合。上述成套试剂中，所述Cpf1-PAM为5′-YTN-3′；所述Cas9-PAM为5′-NGG-3′；其中，Y代表T或C，N代表A，T，G或C。本专利技术进一步提供了上述成套试剂在构建含有外源目的DNA分子的重组载体中的应用。本专利技术是利用Cpf1蛋白和crRNA或Cas9蛋白和gRNA对DNA的特异性识别和断裂能力替代限制性内切酶，并与不依赖DNA连接酶的同源重组克隆方法相结合，运用到载体构建当中，该方法方便、灵活、通用、简单、高效，具体体现在如下几点：1、无需载体上存在特定的限制性内切酶识别位点，不用使用限制性内切酶，gRNA或crRNA对靶点的识别要求是靶点序列的下游或上游存在PAM序列，所以无需在载体上插入具有限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列。2、由于无需在载体中插入多克隆位点序列，在构建重组载体时，可实现载体和插入片段的无缝连接(使用同源重组克隆法进行构建)，不会在载体和插入片段之间引入任何多余序列。3、由于在载体上存在很多PAM序列(平均每16bp会出现一次，加上互补链也可作为识别的靶序列，平均每8bp中就可设计一个靶点)，可以很大几率地在需要改造的序列两侧找到PAM序列进行载体断裂，结合同源重组克隆法可以在质粒载体或BAC载体中任何位置进行各种改造，包括插入、缺失和突变。4、为方便使用，可以在载体常用切割位点处引入固定的靶点和PAM序列，这样就可使用固定的gRNA和Cas9蛋白组合或crRNA和Cpf1蛋白组合实现常用位点的切割。附图说明图1为利用CRISPR系统构建重组载体的流程图。图2为pX330载体的结构示意图。图3为Cpf1/crRNA切割位点的设计。图4为切割后的pX330载体的琼脂糖凝胶电泳结果。图5为含同源臂的P2AEGFP片段PCR产物电泳结果。图6为pX330-P2AEGFP菌落PCR鉴定电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法，其特征在于：所述方法为CRISPR/Cpf1法或CRISPR/Cas9法；/n其中，所述CRISPR/Cpf1法包括如下步骤：/n1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cpf1蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM；/n2)以所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列为靶点序列制备crRNA；/n3)利用所述crRNA与Cpf1蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；/n4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体；/n所述CRISPR/Cas9法包括如下步骤：/n1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cas9蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cas9蛋白识别的PAM序列命名为Cas9-PAM；/n2)以所述骨架载体中所述Cas9-PAM的上游DNA序列为靶点序列制备gRNA；/n3)利用所述gRNA与Cas9蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；/n4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体。/n...

【技术特征摘要】
1.构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法，其特征在于：所述方法为CRISPR/Cpf1法或CRISPR/Cas9法；
其中，所述CRISPR/Cpf1法包括如下步骤：
1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cpf1蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM；
2)以所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列为靶点序列制备crRNA；
3)利用所述crRNA与Cpf1蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；
4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体；
所述CRISPR/Cas9法包括如下步骤：
1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cas9蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cas9蛋白识别的PAM序列命名为Cas9-PAM；
2)以所述骨架载体中所述Cas9-PAM的上游DNA序列为靶点序列制备gRNA；
3)利用所述gRNA与Cas9蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；
4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cpf1-PAM的下游DNA序列的长度为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，王德华，王磊，程锐，曾为俊，马翔，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32