内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法。该表达载体以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQ ID NO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。本发明专利技术构建的pSix1d74HSPG载体中的pSix1d启动子活性显著高于pCT74HSPG载体中的ToxA启动子活性，可以达到ToxA启动子活性的约1.6倍；新构建的pSix1d74HSPG载体完全可以取代原来的pCT74HSPG载体，利用内源启动子携带尖孢镰刀菌自身的基因侵染香蕉植株，为香蕉枯萎病的分子机理研究提供重要的实验基础。

【技术实现步骤摘要】
内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法。
技术介绍
香蕉枯萎病是危害香蕉产业的重要病害，而尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,Foc)是引起这种病害的病原真菌。Foc有4个生理小种，其中，1号小种(Foc1)和4号小种(Foc4)在我国分布最为广泛。分泌蛋白作为一类重要的致病因子，在Foc侵染香蕉过程中起着重要作用。有研究表明，病原真菌的部分分泌蛋白在其与植物的互作中发挥关键作用，但具体的互作机理仍鲜见报道。尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中会分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白(15.8～29.9kD)进入木质部中启动致病力，被称为Six(secretedinxylem)蛋白。目前为止，在Fol(番茄枯萎病菌)中已被鉴定到的Six蛋白从Six1到Six14，已有14个。本研究团队前期对尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种的分泌蛋白质组研究结果发现，Six1d蛋白是尖孢镰刀菌中高丰度分泌蛋白之一。为了详细研究Six1d蛋白在尖孢镰刀菌致病过程中的具体作用机制，本研究团队构建了74HSP-EGFP重组载体(详见申请号为201911247436X专利中公开的载体)，但该pCT74载体中ToxA启动子来自于真菌Pyrenophoratriticirepentis，需要寻找一种活性相当甚至更强的尖孢镰刀菌内源启动子来驱动Six1d蛋白的表达。r>
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法。该尖孢镰刀菌分泌表达载体中的pSix1d启动子活性显著高于74HSP-EGFP重组载体中的ToxA启动子活性，可以达到ToxA启动子活性的约1.6倍。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体，以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQIDNO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。本研究团队前期对尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种的分泌蛋白质组研究结果发现，Six1d蛋白是尖孢镰刀菌中高丰度表达的分泌蛋白之一。为了详细研究Six蛋白及其它分泌蛋白在尖孢镰刀菌致病过程中的具体作用机制，本研究克隆了Six1d基因的启动子，将本研究团队已改进的一种真菌分泌表达载体中的组成型表达启动子ToxA进行替换，构建尖孢镰刀菌自身启动子驱动的一种真菌分泌表达载体；通过比较ToxA启动子和pSix1d基因启动子驱动表达的绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)表达丰度，以及荧光强度，来验证Six1d基因启动子的活性，为后续研究尖孢镰刀菌蛋白与香蕉的互作机理提供重要的实验基础。作为优选，pCT74HSPG载体为：在pCT74载体的4665bp处插入Six1d分泌蛋白N端23aa的胞外信号肽的真菌分泌型表达载体74HSP。作为优选，胞外信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。作为优选，胞外信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。在本专利技术中，Six1d基因启动子来源于尖孢镰刀菌1号生理小种的基因组。本专利技术还提供了该尖孢镰刀菌分泌表达载体的构建方法，以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQIDNO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。作为优选，构建方法具体为：利用限制性内切酶将pCT74HSPG的ToxA启动子区和分泌信号肽序列酶切下来，补平粘性末端后，将Six1d基因启动子和分泌信号肽序列通过平末端连接进分泌载体pCT74HSPG中。作为优选，限制性内切酶为HindIII和ClaI。本专利技术还提供了一种Foc4转化菌，其构建方法为：将上述尖孢镰刀菌分泌表达载体转化入尖孢镰刀菌Foc4。本专利技术还提供了该Foc4转化菌的构建方法，将上述尖孢镰刀菌分泌表达载体转化入尖孢镰刀菌Foc4。本专利技术提供了内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法。该表达载体以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQIDNO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。本专利技术具有的技术效果为：本专利技术构建的pSix1d74HSPG载体中的pSix1d启动子活性显著高于pCT74HSPG载体中的ToxA启动子活性，可以达到ToxA启动子活性的约1.6倍；新构建的pSix1d74HSPG载体完全可以取代原来的pCT74HSPG载体，利用内源启动子携带尖孢镰刀菌自身的基因侵染香蕉植株，为香蕉枯萎病的分子机理研究提供重要的实验基础。附图说明图1示pSix1d74HSPG载体的构建图；图2示固体培养基和液体培养基荧光观察，其中，Foc4代表Foc4野生型菌株；ToxA::74HSPG和pSix1d::74HSPG分别表示pCT74HSPG和pSix1d74HSPG载体转化Foc4的阳性菌株；图3示液体培养基中的EGFP荧光强度检测，其中，Foc4代表Foc4野生型菌株；pCT74HSPG和pSix1d74HSPG分别表示pCT74HSPG和pSix1d74HSPG载体转化Foc4的阳性菌株；图4示液体培养基上清蛋白的1-DE检测(A)和Westernblot实验，其中，Foc4代表Foc4野生型菌株；pCT74HSPG和pSix1d74HSPG分别表示pCT74HSPG和pSix1d74HSPG载体转化Foc4的阳性菌株。具体实施方式本专利技术公开了内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。实施例1中pCT74HSPG载体为申请号为201911247436X专利中的74HSP-EGFP重组载体，具体构建方法如下：(一)胞外信号肽的确定及包含酶切位点的短序列的设计1、本专利技术通过分泌蛋白质组学从尖孢镰刀菌古巴专化型一号小种(Foc1)中鉴定到一个表达丰度很高的分泌蛋白Six1d，并通过信号肽分析，预测到该蛋白序列N端存在1个21aa的胞外信号肽，21aa和22aa间可以实现蛋白的剪切和分泌，而N端的23aa、甚至30aa单独使用时都无法预测到有效剪切，虽然使用该蛋白N端40aa和50aa的序列可实现蛋白剪切和分泌，但当使用40aa或50aa的序列构建的载体时，会在目的蛋白N端遗留较长的序列，影响目的蛋白的功能。2、具体实验如下：(1)单独使用N端2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体，其特征在于，以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQ ID NO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。/n

【技术特征摘要】
1.一种内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体，其特征在于，以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQIDNO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。


2.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌分泌表达载体，其特征在于，所述pCT74HSPG载体为：在pCT74载体的4665bp处插入Six1d分泌蛋白N端23aa的胞外信号肽的真菌分泌型表达载体74HSP。


3.根据权利要求2所述的尖孢镰刀菌分泌表达载体，其特征在于，所述胞外信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


4.根据权利要求2或3所述的尖孢镰刀菌分泌表达载体，其特征在于，所述胞外信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。


5.根据权利要求1至3中任一项所述的尖孢镰刀菌分泌表达载体，其特征在于，所述Six1d基因启动子来源于尖孢镰刀菌1号生理小种的基因组。


6.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：常丽丽，仝征，彭存智，王丹，徐兵强，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46