基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法技术

本发明专利技术提供基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，包括：(1)，设计两对引物，其中一对为突变引物即MPF和MPR，这对引物的5'端互补序列长度为12‑15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1‑20bp；另一对引物是协助PCR的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为PCR可变引物PCRVF和PCRVR；(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化；(3)重组酶连接反应；(4)转化，质粒提取和测序分析。本发明专利技术可在其互补区域取任意置换碱基，进行任意长度的缺失突变，长片段拆入突变，可以用于大载体DNA定点突变而且表现出很高突变效率。

【技术实现步骤摘要】
基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法。
技术介绍
基因的定点突变技术是二十世纪生物化学和分子生物学领域里最重要的发现之一，它为人类了解生物体基因的功能，蛋白质及其基序的结构域和功能，由基因突变导致的遗传疾病发生的致病机制提供了强有力的研究手段。基因的定点突变技术可通过多种实验手段完成；其中，聚合酶链式反应(PCR)指导的定点突变技术具有简单，快速，方便等特点，在生物学，农学和医学等领域中应用广泛。PCR介导的定点突变技术目前一般只适合于大小为3kb至10kb载体或质粒中的基因突变，而且，随着载体大小增加，突变的效率明显降低。对于载体大小在10kb以上的基因突变，不仅费时费力，消耗大量资金，而且突变效率极低。由于生物体基因组中包含大量编码蛋白的超大基因，这些基因被克隆在载体中往往超过了10kb，有的甚至将近20kb。利用现有的PCR定点突变技术突变如此大的DNA分子时经常感到束手无策。因此，有必要专利技术一种突变DNA超大分子的PCR定点突变技术。现有技术中，利用包含突变位点的双链DNA小分子(或称完全互补引物)和PCR反应，经DpnI酶切和感受态细菌转化等实验流程完成DNA定点突变的技术，该技术适合分子量较小的DNA定点突变，具有简单，快速等特点，Stratagene公司生产的定点突变试剂盒就是基于此方法。但是由于引物自身能够配对结合，PCR产物含量极低，突变效率极低，即便是小分子的DNA载体，通常一次实验不能完成，需要反复尝试才可成功；对PCR条件要求高，不方便进行多点突变，插入突变和缺失突变或者此对类突变效率极低。不能用于大载体或大DNA分子的定点突变。另外，利用包含突变位点的一对5'端互补引物和PCR反应，经DpnI酶切和感受态细菌转化等实验流程完成DNA定点突变的技术。该技术适合分子量较中或小的DNA分子定点突变，具有简单，快速以及完成多种突变等特点，此方法是上面现有技术的改进型。但是由于PCR引物5'端仍有一端分互补序列，导致PCR产物降低，突变效率降低；而在载体较小，反应良好的情况下，反应产物两端会产生多余的重复序列，这时若想获得正确突变体，需要借助另外一种方法即同源重组的方法完成。但是此方法仍然对大载体DNA的突变无效。再者，利用包含突变位点的一对不互补引物完成反向PCR反应(突变位点包含在其中一个引物5'端中)，经DpnI酶切，PCR产物纯化，产物末端加磷，连接反应和感受态细菌转化等实验完成定点突变的技术。相比较上面两种现有技术，这一方法具有更好的重复性和更高的突变效率，能够完成多位点突变，插入和缺失突变，适合于中小载体的突变。但是此方法较上面现有技术程序更为复杂，DNA模板需要DpnI酶切，PCR产物的纯化，磷酸化和连接酶连接等步骤。但对大载体DNA的突变依然无效。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，解决目前克隆于大载体(10kb以上)上的基因或DNA的定点突变的技术难题，或者载体和基因总共大于10kbDNA分子的定点突变技术难题。具体技术方案为：基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，包括以下步骤：(1)定点突变引物设计设计两对引物，其中一对为突变引物即MPF和MPR，这对引物的5'端互补序列长度为12-15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1-20bp；另一对引物是协助PCR的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为PCR可变引物PCRVF和PCRVR(图1A)；(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化(i)以0.5-1ngDNA为模板，用PhantaMax超保真DNA聚合酶分别设立两个不同的PCR反应；(ii)PCR热循环；(iii)利用Axygen胶回收试剂盒按照试剂盒说明书回收纯化以上两种PCR产物，利用琼脂糖凝胶电泳对回收产物进行鉴定；(3)重组酶连接反应将上述步骤(2)中子步骤(iii)中纯化的DNA按照等摩尔数混合，利用重组酶ExnaseII完成连接反应；(4)转化，质粒提取和测序分析。进一步的，步骤(2)中子步骤(i)两个不同的PCR反应的体系如下：PCR反应体系I包括:DNA模板0.5ng或稀释的DNA1μL，引物MPF和引物PCRVR各0.5μL，含PhantaMax超保真DNA聚合酶反应混合物(2x)20μL，双蒸水18.5μL，共40μL；PCR反应体系II包括:DNA模板0.5ng或稀释的DNA1μL，引物PCRVF和引物MPR各0.5μL，含PhantaMax超保真DNA聚合酶反应混合物(2x)20μL，双蒸水18.5μL，共40μL。其中，步骤(2)中的子步骤(ii)PCR热循环为：(1)95℃3分钟；(2)95℃1分钟，55℃15秒，72℃1-10分钟，取决于PCRDNA产物长度，1kb/30秒，35个循环；(3)72℃5分钟。优选的，步骤(3)所述的连接反应，为20μL反应体系：PCR产物IxμL，PCR产物IIyμL，5x连接酶缓冲液，ExnaseII1μL，加ddH2O至20μL，25℃下连接15-20min。步骤(4)转化，质粒提取和测序分析，具体步骤为：(i)转化：取细菌感受态细胞30μL置于冰上，加入步骤(3)中的连接产物3μL，冰浴45min；冰浴完成后于42℃水浴锅中热激60sec，置冰上冰浴2min后加入200μLSOC溶液，转至37℃摇床上振荡1h；将转化连接产物的感受态细胞均匀涂在含抗生素的LB固体培养基上并置于37℃恒温箱培养14-16h；(ii)质粒提取：用接菌环从LB培养皿中挑取单菌落接种于3mLLB液体培养基中，转至37℃摇床振荡培养过夜或16h；菌液转入离心管中和在12000rpm速度下离心，收集菌体；利用Axygen质粒提取试剂盒按照试剂盒说明书提取质粒；取3μL质粒完成琼脂糖凝胶电泳分析；(iii)测序分析：取1μg质粒，送测序公司完成DNA测序，分析定突变位置的序列是否突变；若每个突变反应完成多个质粒的提取和测序分析，则可分析出此方法完成的每个突变反应的突变效率。本专利技术方法具有的优点包括：(1)是一种新颖的针对传统方法不能对付的克隆于大载体/质粒上的基因或者大基因(10kb-20kb)的定点突变方法。(2)不涉及搭桥PCR(overlappingPCR)。(3)不涉及传统基因克隆，而是，PCR产物纯化后，采用重组酶方法连接，一般只需要15-20分钟即可转化，时间短，方法相对简单。(3)针对的是载体DNA，只需要两次普通PCR，而搭桥突变方法则针对要克隆的基因，至少完成两次普通PCR，一次搭桥PCR。(4)引物的灵活性很高，采用两对部分互补引物完成，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)定点突变引物设计/n设计两对引物，其中一对为突变引物即MPF和MPR，这对引物的5'端互补序列长度为12-15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1-20bp；另一对引物是协助PCR的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为PCR可变引物PCRVF和PCRVR；/n(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化/n(i)以0.5-1ng DNA为模板，用Phanta Max超保真DNA聚合酶分别设立两个不同的PCR反应；/n(ii)PCR热循环；/n(iii)利用Axygen胶回收试剂盒按照试剂盒说明书回收纯化以上两种PCR产物，利用琼脂糖凝胶电泳对回收产物进行鉴定；/n(3)重组酶连接反应/n将上述步骤(2)中子步骤(iii)中纯化的DNA按照等摩尔数混合，利用重组酶Exnase II完成连接反应；/n(4)转化，质粒提取和测序分析。/n

【技术特征摘要】
1.基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)定点突变引物设计
设计两对引物，其中一对为突变引物即MPF和MPR，这对引物的5'端互补序列长度为12-15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1-20bp；另一对引物是协助PCR的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为PCR可变引物PCRVF和PCRVR；
(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化
(i)以0.5-1ngDNA为模板，用PhantaMax超保真DNA聚合酶分别设立两个不同的PCR反应；
(ii)PCR热循环；
(iii)利用Axygen胶回收试剂盒按照试剂盒说明书回收纯化以上两种PCR产物，利用琼脂糖凝胶电泳对回收产物进行鉴定；
(3)重组酶连接反应
将上述步骤(2)中子步骤(iii)中纯化的DNA按照等摩尔数混合，利用重组酶ExnaseII完成连接反应；
(4)转化，质粒提取和测序分析。


2.根据权利要求1所述的基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，其特征在于，步骤(2)中子步骤(i)两个不同的PCR反应的体系如下：
PCR反应体系I包括：DNA模板0.5ng或稀释的DNA1μL，引物MPF和引物PCRVR各0.5μL，含PhantaMax超保真DNA聚合酶反应混合物(2x)20μL，双蒸水18.5μL，共40μL；
PCR反应体系II包括：DNA模板0.5ng或稀释的DNA1μL，引物PCRVF和引物MPR各0.5μL，含PhantaMax超保真DNA聚合酶反应混合物(2x)20μL，双蒸水18.5μL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓文生，史开拓，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42