基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法技术

本发明专利技术提供基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，包括：(1)，设计两对引物，其中一对为突变引物即MPF和MPR，这对引物的5'端互补序列长度为12‑15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1‑20bp；另一对引物是协助PCR的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为PCR可变引物PCRVF和PCRVR；(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化；(3)重组酶连接反应；(4)转化，质粒提取和测序分析。本发明专利技术可在其互补区域取任意置换碱基，进行任意长度的缺失突变，长片段拆入突变，可以用于大载体DNA定点突变而且表现出很高突变效率。

【技术实现步骤摘要】
基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法。
技术介绍
基因的定点突变技术是二十世纪生物化学和分子生物学领域里最重要的发现之一，它为人类了解生物体基因的功能，蛋白质及其基序的结构域和功能，由基因突变导致的遗传疾病发生的致病机制提供了强有力的研究手段。基因的定点突变技术可通过多种实验手段完成；其中，聚合酶链式反应(PCR)指导的定点突变技术具有简单，快速，方便等特点，在生物学，农学和医学等领域中应用广泛。PCR介导的定点突变技术目前一般只适合于大小为3kb至10kb载体或质粒中的基因突变，而且，随着载体大小增加，突变的效率明显降低。对于载体大小在10kb以上的基因突变，不仅费时费力，消耗大量资金，而且突变效率极低。由于生物体基因组中包含大量编码蛋白的超大基因，这些基因被克隆在载体中往往超过了10kb，有的甚至将近20kb。利用现有的PCR定点突变技术突变如此大的DNA分子时经常感到束手无策。因此，有必要专利技术一种突变DNA超大分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)定点突变引物设计/n设计两对引物，其中一对为突变引物即MPF和MPR，这对引物的5'端互补序列长度为12-15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1-20bp；另一对引物是协助PCR的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为PCR可变引物PCRVF和PCRVR；/n(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化/n(i)以0.5-1ng DNA为模板，用Phanta Max超保真DNA聚合酶分别设立两个不同的PCR反...

【技术特征摘要】
1.基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)定点突变引物设计
设计两对引物，其中一对为突变引物即MPF和MPR，这对引物的5'端互补序列长度为12-15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1-20bp；另一对引物是协助PCR的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为PCR可变引物PCRVF和PCRVR；
(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化
(i)以0.5-1ngDNA为模板，用PhantaMax超保真DNA聚合酶分别设立两个不同的PCR反应；
(ii)PCR热循环；
(iii)利用Axygen胶回收试剂盒按照试剂盒说明书回收纯化以上两种PCR产物，利用琼脂糖凝胶电泳对回收产物进行鉴定；
(3)重组酶连接反应
将上述步骤(2)中子步骤(iii)中纯化的DNA按照等摩尔数混合，利用重组酶ExnaseII完成连接反应；
(4)转化，质粒提取和测序分析。


2.根据权利要求1所述的基于重组酶和超保真DNA聚合酶的大载体DNA的定点突变方法，其特征在于，步骤(2)中子步骤(i)两个不同的PCR反应的体系如下：
PCR反应体系I包括：DNA模板0.5ng或稀释的DNA1μL，引物MPF和引物PCRVR各0.5μL，含PhantaMax超保真DNA聚合酶反应混合物(2x)20μL，双蒸水18.5μL，共40μL；
PCR反应体系II包括：DNA模板0.5ng或稀释的DNA1μL，引物PCRVF和引物MPR各0.5μL，含PhantaMax超保真DNA聚合酶反应混合物(2x)20μL，双蒸水18.5μL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓文生，史开拓，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42