一种pCUP1载体质粒的构建及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种pCUP1载体质粒的构建方法和一种外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法；其中所述pCUP1载体质粒的构建方法包括以下步骤：采用PCR扩增体系对酿酒酵母中的CUP1基因进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收所述PCR产物，得到CUP1基因片段；采用BamH I限制性核酸内切酶对pPICZα A载体进行酶切，得到酶切产物，采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pPICZα A载体；将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZα A载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒。本发明专利技术采用上述pCUP1载体质粒的外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法，在不同浓度的铜离子诱导作用下，促使毕赤酵母自发形成高拷贝外源基因插入，以达到筛选周期短、效率高、成本低的外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法。

【技术实现步骤摘要】
一种pCUP1载体质粒的构建及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种pCUP1载体质粒的构建、采用该pCUP1载体质粒筛选高拷贝插入外源基因的重组毕赤酵母的方法及其应用。
技术介绍
毕赤酵母重组表达系统是一种广泛应用的重组蛋白表达系统。其中采用甲醇启动子的诱导表达方案最为常用，其过程通常为：将外源基因插入到pPIC9k、pPICZαA、pPIC3.5k等带有AOX1启动子的表达质粒中，然后通过电转化的方法，将上述经过线性化的表达质粒转化到毕赤酵母感受态细胞中。在这些方法中，由于所使用的表达质粒带有与宿主基因同源的序列，则外源质粒会与宿主中的同源基因发生重组，进而可将外源基因稳定地整合至毕赤酵母基因组中，而这些表达质粒上带有的Zeocin或者g418抗性基因将同时被整合至毕赤酵母基因组，实现组成型表达，然后利用抗性筛选方法就可鉴定是否正确插入了所述外源基因的克隆。在这些筛选方法中，转化子耐受抗生素的浓度与该转化子中的外源基因整合拷贝数在一定范围内成正相关，因此利用不同浓度的抗生素平板即可筛选出插入了不同拷贝数外源基因的克隆子。进一步而言，所述pPIC9k、pPICZαA、pPIC3.5k质粒同源整合而发生高拷贝整合事件是一种随机低概率事件。通常，为了筛选高拷贝插入外源基因的转化子，需要将大量的转化子逐个依次用从低到高浓度的Zeocin或者g418抗生素平板进行筛选，最终在高浓度抗生素平板中能存活下来的克隆即为外源基因多拷贝插入的转化子。这种方法的缺陷在于，该方法通常要筛选几百甚至上千个转化子，先后经过4-5种不同浓度的平板的筛选，最终仅能得到几个高拷贝的克隆，效率较低；此外，毕赤酵母对g418抗生素有较强的耐受性，在筛选过程中容易出现假阳性，其表达量与药物浓度相关性不明显。而且Zeocin试剂的价格贵，其在低浓度时不容易筛到高表达的菌株，而其在高浓度时极容易杀死所有的克隆产物。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术的目的在于建立一种带有抗铜基因(CUP1基因)的pCUP1载体质粒，并利用CUP1基因在不同浓度的铜离子诱导作用下，促使毕赤酵母自发形成高拷贝外源基因插入，以达到筛选周期短、效率高、成本低的外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法。用于实现上述目的的技术方案如下：本专利技术提供一种pCUP1载体质粒的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：采用PCR扩增体系对酿酒酵母中的CUP1基因进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收所述PCR产物，得到CUP1基因片段；采用BamHI限制性核酸内切酶对pPICZαA载体进行酶切，得到酶切产物，采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pPICZαA载体；将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒(序列表见附件)；其中，所述PCR扩增体系中的扩增引物为：上游引物F：5'TGAGACCTTCGTTTGTGCGcaatagaggcaggtatc，下游引物R：5'ATGGTGTGTGGGGGATCattcctttaattgctaa；所述PCR扩增体系为100ul，其包括：10×扩增缓冲液10ul，dATP200umol/L，dGTP200umol/L，dTTP200umol/L，dCTP200umol/L，所述上游引物F10～100pmol，所述下游引物R10～100pmol，模板DNA0.1～2ug，TaqDNA聚合酶2.5u，Mg2+1.5mmol/L，余量为双蒸水和/或三蒸水；所述PCR扩增体系的反应条件为：依次序在温度为94℃下变性60秒、在温度为55-60℃下退火60秒、在温度为72℃下衍生120秒，并重复25-30个循环。在一个实施方案中，本专利技术所述的pCUP1载体质粒的构建方法中，所述电泳回收为琼脂糖核酸电泳回收；优选地，所述采用BamHI限制性核酸内切酶对pPICZαA载体进行酶切，得到酶切产物；采用电泳回收酶切产物，得到酶切后的pPICZαA载体，包括：将pPICZαA载体2-5μg和BamHI限制性核酸内切酶20-50u混合，得到混合物；将所述混合物在温度为37℃下过夜酶切，得到所述酶切产物，后采用琼脂糖核酸电泳回收所述酶切产物，得到所述酶切后的pPICZαA载体；优选地，所述将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒，包括：采用EasyGeno快速重组克隆试剂盒，将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒。本专利技术还提供一种外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法，其采用本专利技术所述的pCUP1载体质粒，所述筛选方法包括：采用EcoRI限制性核酸内切酶和NotI限制性核酸内切酶对所述pCUP1载体质粒进行双酶切，得到酶切产物，后采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pCUP1载体质粒；采用PCR扩增体系对外源基因进行扩增，得到外源基因PCR产物，后采用电泳回收所述外源基因PCR产物，得到外源基因片段；将所述外源基因片段与所述酶切后的pCUP1载体质粒进行连接，得到所述pCUP1-外源基因表达质粒；采用SacI限制性核酸内切酶将所述pCUP1-外源基因表达质粒进行线性化，得到线性化pCUP1-外源基因表达质粒；采用所述线性化pCUP1-外源基因表达质粒转化X33毕赤酵母感受态细胞，后涂布YPDS-Zeocin平板，培养，得到第一菌落；将所述第一菌落接种于第一BMGY液体培养基，得到培养物，将所述培养物接种于第二BMGY液体培养基，得到菌液；采用第三BMGY培养基重悬所述菌液，后涂布第三BMGY平板，培养，得到所述重组毕赤酵母高拷贝菌落；其中，所述YPDS-Zeocin平板包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为2％的葡萄糖，浓度为1mol/L的山梨糖醇，浓度为2％的琼脂，浓度为100ug/ml的Zeocin；所述第一BMGY液体培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为0.3mM的硫酸铜；所述第二BMGY液体培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为1mM的硫酸铜；所述第三BMGY培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为2mM的硫酸铜；所述第三BMGY平板包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，1.5％琼脂糖，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pCUP1载体质粒的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：/n采用PCR扩增体系对酿酒酵母中的CUP1基因进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收所述PCR产物，得到CUP1基因片段；/n采用BamH I限制性核酸内切酶对pPICZαA载体进行酶切，得到酶切产物，采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pPICZαA载体；/n将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒；/n其中，/n所述PCR扩增体系中的扩增引物为：/n上游引物F：5'TGAGACCTTCGTTTGTGCG caatagaggcaggtatc，/n下游引物R：5'ATGGTGTGTGGGGGATC attcctttaattgctaa；/n所述PCR扩增体系为100ul，其包括：/n10×扩增缓冲液10ul，dATP 200umol/L，dGTP 200umol/L，dTTP 200umol/L，dCTP200umol/L，所述上游引物F 10～100pmol，所述下游引物R 10～100pmol，模板DNA 0.1～2ug，Taq DNA聚合酶2.5u，Mg

【技术特征摘要】
1.一种pCUP1载体质粒的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
采用PCR扩增体系对酿酒酵母中的CUP1基因进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收所述PCR产物，得到CUP1基因片段；
采用BamHI限制性核酸内切酶对pPICZαA载体进行酶切，得到酶切产物，采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pPICZαA载体；
将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒；
其中，
所述PCR扩增体系中的扩增引物为：
上游引物F：5'TGAGACCTTCGTTTGTGCGcaatagaggcaggtatc，
下游引物R：5'ATGGTGTGTGGGGGATCattcctttaattgctaa；
所述PCR扩增体系为100ul，其包括：
10×扩增缓冲液10ul，dATP200umol/L，dGTP200umol/L，dTTP200umol/L，dCTP200umol/L，所述上游引物F10～100pmol，所述下游引物R10～100pmol，模板DNA0.1～2ug，TaqDNA聚合酶2.5u，Mg2+1.5mmol/L，余量为双蒸水和/或三蒸水；
所述PCR扩增体系的反应条件为：
依次序在温度为94℃下变性60秒、在温度为55-60℃下退火60秒、在温度为72℃下衍生120秒，并重复25-30个循环。


2.根据权利要求1所述的pCUP1载体质粒的构建方法，其特征在于，所述电泳回收为琼脂糖核酸电泳回收；
优选地，所述采用BamHI限制性核酸内切酶对pPICZαA载体进行酶切，得到酶切产物；采用电泳回收酶切产物，得到酶切后的pPICZαA载体，包括：将pPICZαA载体2-5μg和BamHI限制性核酸内切酶20-50u混合，得到混合物；将所述混合物在温度为37℃下过夜酶切，得到所述酶切产物，后采用琼脂糖核酸电泳回收所述酶切产物，得到所述酶切后的pPICZαA载体；
优选地，所述将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒，包括：采用EasyGeno快速重组克隆试剂盒，将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒。


3.一种外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法，其采用根据权利要求1或2所述的pCUP1载体质粒，所述筛选方法包括：
采用EcoRI限制性核酸内切酶和NotI限制性核酸内切酶对所述pCUP1载体质粒进行双酶切，得到酶切产物，后采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pCUP1载体质粒；
采用PCR扩增体系对外源基因进行扩增，得到外源基因PCR产物，后采用电泳回收所述外源基因PCR产物，得到外源基因片段；
将所述外源基因片段与所述酶切后的pCUP1载体质粒进行连接，得到所述pCUP1-外源基因表达质粒；
采用SacI限制性核酸内切酶将所述pCUP1-外源基因表达质粒进行线性化，得到线性化pCUP1-外源基因表达质粒；
采用所述线性化pCUP1-外源基因表达质粒转化X33毕赤酵母感受态细胞，后涂布YPDS-Zeocin平板，培养，得到第一菌落；
将所述第一菌落接种于第一BMGY液体培养基，得到培养物，将所述培养物接种于第二BMGY液体培养基，得到菌液；
采用第三BMGY培养基重悬所述菌液，后涂布第三BMGY平板，培养，得到所述重组毕赤酵母高拷贝菌落；
其中，
所述YPDS-Zeocin平板包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为2％的葡萄糖，浓度为1mol/L的山梨糖醇，浓度为2％的琼脂，浓度为100ug/ml的Zeocin；
所述第一BMGY液体培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为0.3mM的硫酸铜；
所述第二BMGY液体培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为1mM的硫酸铜；
所述第三BMGY培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为2mM的硫酸铜；
所述第三BMGY平板包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，1.5％琼脂糖，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为2mM的硫酸铜。


4.根据权利要求3所述的外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法，其特征在于，所述用EcoRI限制性核酸内切酶和NotI限制性核酸内切酶对所述pCUP1载体质粒进行双酶切，得到酶切产物，后采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pCUP1载体质粒，包括：将所述pCUP1载体质粒2-5μg、EcoRI限制性核算内切酶5u和NotI限制性核算内切酶20-50u混合，得到混合物；将所述混合物在温度为37℃下过夜酶切，得到酶切产物，后采用琼脂糖核酸电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pCUP1载体质粒；
优选地，所述采用PCR扩增体系对外源基因进行扩增，得到外源基因PCR产物，后采用电泳回收所述外源基因PCR产物，得到外源基因片段，包括：所述采...

【专利技术属性】
技术研发人员：马峰，华权高，廖怡辉，舒芹，张雪娇，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42