构建包含大片段反向互补序列载体的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法：把包含大片段反向互补的目标序列分成两个无反向互补序列的片段(片段1和片段2)，基因合成这两个片段，在每个片段的两端加上TypeIIS酶切位点；经过酶切后片段1和片段2及目标载体间能够产生互补的粘性末端，经连接和转化可得到包含大片段反向互补序列的阳性克隆。此方法能够有效解决包含大片段反向互补序列载体构建的难题，具有重要意义。

Construction of vector containing large reverse complementary sequences

【技术实现步骤摘要】
构建包含大片段反向互补序列载体的方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法。
技术介绍
普通分子生物学实验中经常涉及构建DNA质粒载体，在构建质粒载体过程中，经常遇到目标DNA片段包含大片段的反向互补序列(如构建长双链RNA前体载体)(>100bp)，反向互补序列可以形成发夹结构，从而增加载体构建的难度。当前基因合成是构建DNA载体的重要途经之一，如果需要合成的DNA中包含大片段反向互补序列，进行基因合成难度大，不可行。构建这类载体，通常会采用普通的酶切/连接的方法，先将一个片段放入载体中，再将第二个片段(与已插入的片段形成反向互补结构)插入质粒载体中。但是，这个方法耗时费力，成功率极低，经常出现插入第二个片段后没有阳性克隆生长的情况。另一方面，采用同源重组的方法，因为反向同源序列的存在影响同源重组的过程。因此，如何快速构建包含大片段反向互补序列的载体，是分子生物学操作中经常遇到的难题。ReferencesEnglerC,GruetznerR,KandziaR,MarillonnetS.Goldengateshuffling:aone-potDNAshufflingmethodbasedontypeIIsrestrictionenzymes.PLoSOne,2009,vol.4pg.e5553CermakT,DoyleEL,ChristianM,WangL,ZhangY,SchmidtC,BallerJA,SomiaNV,BogdanoveAJ,VoytasDF.EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting.NucleicAcidsRes.2011Jul；39(12):e82
技术实现思路
本专利技术提供一种快速构建包含大片段反向互补序列载体的方法，能够有效解决构建包含大片段反向互补序列载体的难题，具有重要意义。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：S1：序列分割：把目标序列分解成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含TypeIIS酶切位点；基因合成这两个片段。S2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用typeIIS内切酶进行酶切/连接反应，经酶切后，片段1，片段2和克隆载体能够产生互补的粘性末端，连接反应后片段1，片段2和克隆载体通过粘性末端结合在一起，获得连接产物。进一步地，上述酶切和连接反应在同一反应体系中进行。进一步地，上述步骤S2中还包括加热使酶失活的步骤。进一步地，上述步骤S1中分解成两个无反向互补序列的片段中，分解位点位于两个反向互补序列之间任何两个相邻碱基位点之间。进一步地，上述酶切反应温度为25℃-58℃，连接反应温度为4℃-24℃。进一步地，本专利技术的方法还包括：S3：转化：将连接产物转化至感受态细胞，将感受细胞在平板培养基中进行抗生素筛选。优选地，上述步骤S1中TypeIIS酶是BsaI、BmsBI、BbsI或SpaI。优选地，上述步骤S2连接酶为T4连接酶。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用typeIIS酶切连接系统，可快速成功构建包含大片段反向互补序列的载体。本专利技术公布的方法可操作性强，所需时间短，阳性率高且易掌握等特点，具有重大应用价值。附图说明图1A-1B显示了本专利技术一个实施例合成的包含大片段反向互补序列的目标片段；图2显示了本专利技术实施例的酶切连接反应示意图；图3为本专利技术实施例1的电泳结果图片；图4A-4B显示了本专利技术另一个实施例合成的包含大片段反向互补序列的目标片段；图5为本专利技术实施例2的电泳结果图片鉴定图片。具体实施方式为了便于本领域技术人员理解，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术进行进一步描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种包含大片段反向互补序列载体构建的方法，主要包括以下步骤：1.包含大片段反向互补序列的分割：把包含2个大片段反向互补的目标序列分成两个无反向互补序列的片段(片段1和片段2)，基因合成这两个片段，在两端加上typeIIS酶切位点(如BsaI或BmsBI位点)；经过酶切后片段1和片段2能够产生互补的粘性末端，使不同片段的末端可以依次相连，其中在分解时两个可以互补的序列保持完整，分解的位点可以为两个互补序列之间的序列中的任何位点。2.酶切/连接反应：将合成的两个互补序列和/或载体序列(可以包括克隆载体，也可以不包括克隆载体，即分两步处理)酶切后连接在一起。具体地，将克隆载体100ng，片段1取100ng，片段2取100ng，加入T4连接酶0.4ul，typeIIS内切酶，酶切/连接缓冲液及灭菌水一共10ul,在PCR仪上进行酶切/连接反应。经过3-6个酶切/连接循环反应后，85℃加热使酶失活。3.转化：取5ul步骤2获得的连接产物，转化至感受态细胞；将感受细胞在平板中进行抗生素筛选；4.阳性克隆鉴定：在平板中挑起5-8个单菌落，通过PCR进行阳性克隆鉴定；5.质粒提取：将阳性菌过夜培养，提取质粒备用。本专利技术实施例使用了TypeIIS内切酶，该内切酶是一类较为特殊的内切酶，它们在识别位点下游的特定位置切割DNA，产生4个碱基的粘性末端。因为识别位点与酶切位点分离，酶切后产生的粘性末端可以人为设计。多个DNA片段经一种TypeIIS酶切后，可以产生多个人为设计的粘性末端，不同DNA片段可以通过粘性末端的互补连接在一起，这种克隆技术被称为GoldenGate连接法(Engleretal.,2008)。这种方法跟传统的酶切/连接方法相比，具有以下特点：1.同一酶切反应可产生多种不同粘性末端；2.对多个片段同时进行酶切产生互补的粘性末端；3.酶切/连接反应可在同一试管中进行。在本专利技术中，我们首次采用GoldenGate连接法成功构建了包含大片段反向重复序列的载体，能够有效解决构建包含大片段反向互补序列载体的难题，具有重要意义。本文所描述的“无反向互补序列”是指整个序列长度中自身不会形成发卡结构，本专利技术实施例中该序列长度大于或等于100bp。具体地，目标载体中包含反向互补序列；反向互补序列区域>50bp；反向互补序列碱基的配对率在50％-100％之间，因此其跨度(从第一个碱基至最后一个碱基的长度)可以大于或者等于100bp；大片段反向互补序列可以分割成N个小段(N≥2)进行基因合成；各片段的两端包含typeIIS酶切位点；typeIIS酶除BsaI和BmsBI外，还包含BbsI,SpaI等；除基因合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：/nS1：序列分割：把目标序列分成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含Type IIS酶切位点，合成这两个片段；/nS2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用type IIS内切酶进行酶切，然后用连接酶进行连接，得到连接产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：
S1：序列分割：把目标序列分成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含TypeIIS酶切位点，合成这两个片段；
S2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用typeIIS内切酶进行酶切，然后用连接酶进行连接，得到连接产物。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶切和连接反应在同一反应体系中进行。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中还包括加热使酶失活的步骤。


4.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云，杨玲玲，
申请(专利权)人：深圳市泽龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44