构建包含大片段反向互补序列载体的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法：把包含大片段反向互补的目标序列分成两个无反向互补序列的片段(片段1和片段2)，基因合成这两个片段，在每个片段的两端加上TypeIIS酶切位点；经过酶切后片段1和片段2及目标载体间能够产生互补的粘性末端，经连接和转化可得到包含大片段反向互补序列的阳性克隆。此方法能够有效解决包含大片段反向互补序列载体构建的难题，具有重要意义。

Construction of vector containing large reverse complementary sequences

【技术实现步骤摘要】
构建包含大片段反向互补序列载体的方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法。
技术介绍
普通分子生物学实验中经常涉及构建DNA质粒载体，在构建质粒载体过程中，经常遇到目标DNA片段包含大片段的反向互补序列(如构建长双链RNA前体载体)(>100bp)，反向互补序列可以形成发夹结构，从而增加载体构建的难度。当前基因合成是构建DNA载体的重要途经之一，如果需要合成的DNA中包含大片段反向互补序列，进行基因合成难度大，不可行。构建这类载体，通常会采用普通的酶切/连接的方法，先将一个片段放入载体中，再将第二个片段(与已插入的片段形成反向互补结构)插入质粒载体中。但是，这个方法耗时费力，成功率极低，经常出现插入第二个片段后没有阳性克隆生长的情况。另一方面，采用同源重组的方法，因为反向同源序列的存在影响同源重组的过程。因此，如何快速构建包含大片段反向互补序列的载体，是分子生物学操作中经常遇到的难题。ReferencesEnglerC,GruetznerR,KandziaR,Marillon本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：/nS1：序列分割：把目标序列分成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含Type IIS酶切位点，合成这两个片段；/nS2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用type IIS内切酶进行酶切，然后用连接酶进行连接，得到连接产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：
S1：序列分割：把目标序列分成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含TypeIIS酶切位点，合成这两个片段；
S2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用typeIIS内切酶进行酶切，然后用连接酶进行连接，得到连接产物。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶切和连接反应在同一反应体系中进行。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中还包括加热使酶失活的步骤。


4.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云，杨玲玲，
申请(专利权)人：深圳市泽龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44