一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K制造技术

本发明专利技术公开了一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K

Improvement of vitamin K biosynthesis by Bacillus natto

【技术实现步骤摘要】
一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法
本专利技术涉及遗传工程
，特别涉及一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法。
技术介绍
维生素K2(MK-7)[本文中简称MK-7]，又称七烯甲萘醌，英文名称：Menaquinone-7，CASNo.：2124-57-4，是维生素K的活性体之一，是由一个甲基萘醌母环和七个异戊二烯侧链连接而成，是一类重要的脂溶性维生素，是维生素K2中的一种，MK-7作为γ-谷氨酸羧化酶的辅因子，具有半衰期长，生物利用度好的特点。具有显著的治疗和预防骨质疏松(促进骨矿化、促进骨形成、抑制骨钙流失)，抗动脉钙化及骨关节炎，抗肿瘤，抗氧化、延缓衰老、美肤养颜，治疗肝炎，调整消化道的活动，缓解平滑肌的痉挛，预防肝硬化进展为肝癌，治疗维生素K2缺乏性出血症，利尿、强肝解毒，降低血压等功效，目前MK-7得到了食品保健、制药行业的广泛关注，具有很高的市场应用价值。纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)是一种好氧型革兰氏阳性益生菌，属细菌科、芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌的一个亚种，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K

【技术特征摘要】
20200117 CN 20201005174601.一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：启动子文库的构建；
步骤2：含不同启动子序列载体的获得；
步骤3：混合质粒的转化；
步骤4：重组菌株荧光强度的检测；
步骤5：同源重组片段的构建；
步骤6：重组PmytxM启动子纳豆芽孢杆菌的构建；
步骤7：重组PmgapA启动子纳豆芽孢杆菌的构建；
步骤8：重组PmaroK启动子纳豆芽孢杆菌的构建；
步骤9：利用重组PytxM,PgapA和ParoK启动子菌株发酵生产维生素K2(MK-7)。


2.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤1包括随机突变启动子片段获得和融合片段的获得，其中随机突变启动子片段获得包括如下步骤：
以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，采用引物ytxMF和ytxMR以及QuicKMutation基因随机突变试剂盒扩增ytxM基因的上游启动子序列ytxM，得到ytxM不同序列的混合启动子片段PytxM，采用gapAF和gapAR引物用上述方法可以获得PgapA，采用aroKF和aroKR引物用上述方法可以获得aroK不同序列的混合启动子片段ParoK。


3.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤2包括如下步骤：
将含有eGFP的载体pJYW-4采用引物ZTytxMF,ZTytxMR；ZTgapAF,ZgapAR和ZTaroKF，ZTaroKR分别线性化，得到线性化载体片段ZTytxM,ZTgapA，ZTaroK，将载体片段与得到的混合启动子片段分别连接后转化大肠杆菌JM109，提取混合质粒。


4.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤3包括将权利要求2中得到的混合质粒分别转化到纳豆芽孢杆菌感受态细胞中，具体步骤为：
新鲜平板挑单菌落接种于2mlLB培养基中，过夜培养，当其OD600＝0.2时转接到50ml的LB培养集中，并加入0.5M山梨醇，37℃、200rpm培养到OD600＝1.2；
用冷冻离心机4℃下，7000rpm/min离心5min，将收集的菌体使用预冷的电击缓冲液进行洗涤，再离心，反复三次；
最终使用将菌体用预冷的电击缓冲液悬浮后，分装于1.5ml离心管中，每个离心管中分装50μL感受态细胞，每个感受态细胞中加入质粒浓度为1000～2000ng/μL；
将上述混合好的感受态冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯中，电击一次，电转仪设置：0.5～1.0Kv，25μF200Ω，1mm,电击2次，电击完毕立即加入1ml复苏培养基，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板，过夜培养；
挑选平板上长出的单菌落，利用引物tyxMYZF，ytxMYZR进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为800bp，并进行测序。


5.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤4包括如下步骤：
挑取测序正确的菌株各10株，进行96浅孔板培养37℃培养12h，采用酶标仪在523nm处检测每个重组菌株发酵液的荧光强度，提取RNA检测相对转录强度。


6.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤5包括：
在整合PytxM不同序列的混合启动子片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：张广华，刘云，陈立军，区文彩，阮月敏，陆阳，
申请(专利权)人：西宝生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31