本发明专利技术提供了一种高活性碱性磷酸酶的生产方法，具体涉及ibAP II基因编码序列的优化方法：以ibAP II的氨基酸序列SEQ ID NO:1为初始序列，加入氨基酸序列为SEQ ID NO:2的人血清白蛋白的分泌肽，形成能在哺乳动物细胞内分泌表达的高活性ibAPII前体蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；根据SEQ ID NO:3逆向翻译出其cDNA序列，根据宿主细胞密码子偏好，通过密码子优化软件优化cDNA序列以适合宿主细胞表达，形成基因编码序列SEQ ID NO:4；通过miRNA靶标搜索软件找出SEQ ID NO:4中与宿主细胞内miRNA同源的靶标序列，修改该靶标序列，以使在不改变高活性ibAPII前体蛋白活性的前提下，其基因编码序列中不再含有与宿主细胞miRNA靶标序列同源性≥65%的序列，形成能在哺乳动物细胞内高效表达的ibAP II最终基因编码序列SEQ ID NO:5。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种高活性碱性磷酸酶的生产方法，更具体地，涉及一种能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibap ii基因编码序列的优化方法以及碱性磷酸酶ibap ii的制备方法。
技术介绍
1、碱性磷酸酶（ap）是一种二聚体、含锌、非特异性磷酸单酯酶，在从大肠杆菌到哺乳动物的所有生物体中都存在，同一物种内还存在多种碱性磷酸酶的同工酶，各种碱性磷酸酶的酶活差异很大。在真核和原核生物中都存在ap，其同源性约为25-30%。人和高等动物的ap家族包含四个成员（胎盘ap、生殖细胞ap、肠ap和非组织特异性ap），它们位于不同的基因座。各种ap的催化活性差别很大，哺乳动物ap较大肠杆菌ap的kcat高了10-100倍。哺乳动物ap中，牛肠ap（ibap）的活性最高。
2、目前最常用的碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶(bap)、牛肠碱性磷酸酶(ibap)、北极虾碱性磷酸酶（sap）、胎盘碱性磷酸酶(plap) 和分泌性碱性磷酸酶(seap)等。其中，ibap的来源丰富、适用性好、酶活高，被广泛使用。但天然ibap受限于小肠资源有限、生产过程环境污染大，而且牛肠中存在i、ii、iii、iv、v等多种同工酶，ibap ii的酶活在ibap同工酶中最高，达8600 units/mg，应用潜力大。在免疫检测方面，碱性磷酸酶标记的抗体较传统的辣根过氧化物酶标记，具有稳定性高、灵敏度高的优点。碱性磷酸酶也被用于去除核苷酸、蛋白质和生物碱等的磷酸基团。但要从多种同工酶中提取活性最高的ibap ii难度大、得率低、成本高。
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p>3、重组ap有通过cho细胞表达的报道，研究使用了ibap的基因组编码序列，所得ap较天然ap的热稳定性有所增加，但因为产量低、生产成本高而导致经济效益差（weissig h,schildge a, hoylaerts mf, iqbal m, millán jl. cloning and expression of thebovine intestinal alkaline phosphatase gene: biochemicalcharacterization ofthe recombinant enzyme. biochem j. 1993 mar 1; 290 ( pt 2)(pt 2): 503-8. doi:10.1042/bj2900503.）。虽然原则上可以在原核宿主中表达真核生物的ap，但原核生物中表达的ap没有糖基化修饰，而糖基化不仅是保障ap高酶活所必须，而且还是制备酶偶联物所必须。罗氏诊断公司利用酵母表达系统，通过多轮转化提高ap表达框架的整合拷贝数，研制出了能够生产高活性ibap的重组酵母菌，这种ap的酶活可以达到7000-10000u/mg（专利技术专利us6884602）。但酵母表达系统的主要缺点是重组蛋白的糖基化与哺乳动物不一致，并使重组蛋白被过渡糖基化（kulagina n, besseau s, godon c, goldman gh, papon n,courdavault v. yeasts as biopharmaceutical production platforms. front fungalbiol. 2021 sep 22; 2: 733492. doi:10.3389/ffunb.2021.733492.）；此外，重组蛋白在酵母中的过表达还会导致分泌不足问题（huang m, wang g, qin j, petranovic d,nielsen j. engineering the protein secretorypathway of saccharomycescerevisiae enables improved protein production. proc natl acad sci u s a.2018 nov 20;115(47): e11025-e11032. doi: 10.1073/pnas.1809921115.）。4、基因表达调控是复杂的，涉及到dna、rna、蛋白质和环境之间的相互作用。影响基因表达的调控成分常被分解为顺式成分（cis components）和反式成分（transcomponents）。顺式成分是指因dna连锁多态性（等位基因和周围基因）产生的对基因表达的影响，而反式成分则是指与目标基因不连锁的分散产物对基因表达的影响，如转录因子、microrna等。micrornas（mirnas）是一种21-22nt的非编码rna，能够通过识别同源序列和干扰转录、翻译或表观遗传过程来调节基因表达。在动物细胞中，mirna主要来源于两个途径，一是被剪切下来的内含子，其是一种带有分枝的套索结构；另一种是通过rna聚合酶ii以基因间非编码dna或mirna基因簇的dna模板转录而来的pre-mirna。在细胞核内，分枝内含子序列通过去分枝，pre-mirna通过rnase iii drosha分裂，最后均形成含有发夹状结构的前体mirna。这些细胞核内的前体mirna通过exportin-5输出到细胞质中。在细胞质内，前体mirna的发夹结构被dicer切割成两个独立的臂，其中一个臂被加载到rna诱导沉默复合物（risc）的argonaute（ago）蛋白中，并被用作与靶标mrna结合的引导序列。mirna-risc对靶基因mrna的作用主要取决于mirna与靶基因转录序列的互补程度，概括起来：当mirna与靶基因完全互补结合则切割靶mrna；当与靶基因不完全互补结合时则抑制靶基因的翻译；第三种方式是上述两种作用模式的混合，协同完成基因的表达调控（lu tx, rothenberg me.microrna. j allergy clin immunol.2018 apr; 141(4): 1202-1207. doi: 10.1016/j.jaci. 2017. 08. 034）。
5、mirna的作用靶点不仅包括mrna，还包括lncrnas、假基因和circrnas，能够在基因转录后的多个环节调控基因表达。一个mirna可以同时靶向位于同一细胞信号通路内的几个基因，多个mirna也可以同时靶向作用于同一个基因。mirnas存在的广泛性和多样性，提示mirnas具有非常广泛多样的生物功能。mirna已被证明能够影响许多重要的生物学过程，如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育和凋亡等。mirna的异常调节在各种疾病的进展中起着关键作用，如衰老、心血管疾病和癌症。mirnas可以被包装成外泌体或微囊泡分泌到细胞外环境中进行远距离的细胞-细胞通信。循环mirnas也可以作为各种癌症以及其他疾病的诊断和预后指标。
6、尽管对mirna的研究还不够完善，但mirnas在高等真核生物体内对基因表达的调控作用被认为可能和转录因子一样重要，代表了一个新层次上的基因表达调控方式。
7、生物信息学的发展为mirna的识别和功能分析提供了高效手段，有研究列述了近百种与mirna相关的生物信息学分析工具，这些工具涵盖了mirn本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibAP II基因编码序列的优化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibAP II基因编码序列的优化方法，其特征在于，
3.根据权利要求1或2所述的能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibAP II基因编码序列的优化方法，其特征在于，
4.根据权利要求1或2所述的能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibAP II基因编码序列的优化方法，其特征在于，
5.一种能在哺乳动物细胞内高效表达的ibAP II表达载体，其特征在于，所述ibAP II表达载体含有如权利要求1所述的最终基因编码序列SEQ ID NO:5。
6.一种碱性磷酸酶ibAP II的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的碱性磷酸酶ibAP II的制备方法，其特征在于，
8.根据权利要求6所述的碱性磷酸酶ibAP II的制备方法，其特征在于，
【技术特征摘要】
1.一种能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibap ii基因编码序列的优化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibap ii基因编码序列的优化方法，其特征在于，
3.根据权利要求1或2所述的能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibap ii基因编码序列的优化方法，其特征在于，
4.根据权利要求1或2所述的能在哺乳动物细胞内高效表达的碱性磷酸酶ibap ii基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘思国，赵东葵，陈立军，张广华，
申请(专利权)人：西宝生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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