一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法，属于乳粉品质检测技术领域。所述方法是：样品经脂肪酶酶解，采用快速的碳酸钾‑乙醇皂化法，正己烷提取，经气相色谱‑串联质谱分析，同时获得定性和定量结果。胆固醇在0.5～50mg/L，α‑生育酚、β‑生育酚、γ‑生育酚、δ‑生育酚在0.25～25mg/L范围内具有较好的线性关系，线性系数(R

【技术实现步骤摘要】
一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法
本专利技术涉及一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法，属于乳粉品质检测

技术介绍
胆固醇和生育酚都是人体所必需的重要营养元素，是乳粉中的重要质量指标。胆固醇参与人体代谢，是合成类固醇激素的原料，也是胆汁酸、激素和维生素D的前体。维生素E(vitaminE，VE)又称生育酚，是一种人体必需的脂溶性维生素，对维持人体正常生理功能起重要作用，能提高机体免疫力、生育能力，也是人体内最重要的抗氧化剂。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类8种化合物，其中生物效价较高的4种是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。目前，国家标准中用于检测食品中胆固醇和维生素E是两个不同的方法，且均需要经过传统的加热回流皂化、分液漏斗多次液液萃取、洗涤、浓缩，再用高效液相色谱或气相色谱法分离，而文献报道的关于维生素E或者胆固醇的方法几乎也都是与国家标准相同的前处理方法。这些前处理方法过程复杂、耗时长，色谱法分离胆固醇的干扰较大。目前对于胆固醇和混合生育酚同时检测的方法报道甚少。此外，严婉盈等采用固相萃取(SolidPhaseExtraction,SPE)法测定胆固醇，但是该方法只能测定游离胆固醇而非总胆固醇，影响结果准确性，该文献将SPE用于测定植物油的方法并不适用于乳粉的前处理。
技术实现思路
鉴于乳粉基质成分复杂，本专利技术通过多次实验摸索了一种适用于各种乳粉中胆固醇和混合生育酚定性定量检测的方法，采用快速准确的简易皂化提取的前处理方法，用气相色谱三重四级杆质谱联用仪多反应监测(MRM)模式定性和定量，相比简单的气相色谱、液相色谱及单杆质谱更加准确。本研究将此快速法与国标方法进行了比对，并将本方法应用于快速同时测定各种乳粉中胆固醇和混合生育酚的含量。该方法简便、快速、灵敏、准确，可满足乳粉中胆固醇和混合生育酚的检测要求，为乳粉品质的快速检测奠定了理论基础。本专利技术的第一个目的是提供一种提取乳粉中胆固醇和生育酚的预处理方法，所述方法是先采用脂肪酶酶解乳粉样品，再采用碳酸钾-无水乙醇溶液进行皂化处理，最后经提取溶剂提取得到胆固醇和生育酚混合溶液。在本专利技术一种实施方式中，所述生育酚包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。在本专利技术一种实施方式中，所述酶解条件为：脂肪酶添加量为100-150U/mg样品，pH为8.0-9.0，温度为30-40℃，酶解时间为2-10h。在本专利技术一种实施方式中，所述碳酸钾-无水乙醇溶液与样品的用量比的(5-15)：1(v/w，mL/g)；碳酸钾-无水乙醇溶液中碳酸钾质量体积浓度为5％-10％(w/v，g/mL)。在本专利技术一种实施方式中，所述皂化处理条件为：皂化温度为20-40℃，皂化时间为10-20min。在本专利技术一种实施方式中，萃取溶剂为正己烷、石油醚:乙醚(1:1)或乙酸乙酯；优选地，溶剂为正己烷，萃取溶剂体积为2-10mL；萃取时间为5-15min。优选地，萃取溶剂为正己烷，萃取溶剂体积为5mL，萃取时间为10min。在本专利技术一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：(1)酶解和快速皂化：称取乳粉样品2.00g于50mL离心管中，加入5mL37℃水溶解，加入0.2g脂肪酶，5mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)，混匀后置于37℃振荡水浴中酶解4小时。取出后立即冷却，待冷却至室温后依次加入1g碳酸钾、10mL超纯水、10mL无水乙醇充分混合后20℃水域震荡10min；(2)提取：向步骤(1)中继续加入5mL正己烷充分涡旋萃取10min，4000r/min离心6min，取上清液过0.22μm有机膜，待测定。本专利技术的第二个目的是提供一种同时检测乳粉中胆固醇和生育酚含量的方法，所述方法是应用上述预处理方法对乳粉中的胆固醇和生育酚进行提取，再采用气相色谱串联质谱法对胆固醇和生育酚进行定量检测。在本专利技术一种实施方式中，色谱条件为：色谱柱为30m×0.25mm×0.25μmTG-5MSSil，进样口温度280℃，不分流模式进样，进样量2μL，载气流速：1.5mL/min；升温程序为：初始柱温150℃，维持1min，然后以10℃/min升至280℃，维持12min，最后20℃/min升至300℃，保持3min。在本专利技术一种实施方式中，质谱条件：电子轰炸EI离子源，扫描方式为正离子扫描；多反应监测MRM模式，离子源温度300℃，接口温度300℃。本专利技术第三个目的是提供一种所述预处理方法和检测方法在检测婴幼儿配方奶粉和低脂乳粉品质方面的应用。本专利技术的有益效果：鉴于现行胆固醇和4种生育酚的测定分别采用国家标准GB5009-2016《食品中维生素A、D、E的测定》第一法，GB5009-2016《食品中胆固醇的测定》。前处理方法过程复杂、耗费时间长，而且不能同时测定胆固醇和4种生育酚。本专利技术前处理只需经过酶解、常温皂化、直接萃取3个步骤，无需转移和多次萃取，高效便捷，且可以批量处理样品。本专利技术采用气质联用仪相比液相法、气相法定性定量更加准确、干扰少，胆固醇在0.5～50mg/L，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚在0.25～25mg/L范围内具有较好的线性关系，线性系数(R2)大于0.999，加标回收率为77％～93.1％，相对标准偏差为1.4～3.5，胆固醇定量限为10.0μg/100g，维生素E四种异构体的定量限均为5.0μg/100g，本方法检出限、线性、回收率均能满足乳粉中胆固醇和4种生育酚的检测要求。该方法简便、快速、灵敏、准确，可满足乳粉中胆固醇和混合生育酚的检测要求，为乳粉品质的快速检测奠定了理论基础。附图说明图1为5种物质的定量离子提取图。图2为不同酶解时间对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。图3为不同皂化温度对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。图4为不同萃取剂对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。图5为不同萃取溶剂体积对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。图6为胆固醇和4种生育酚的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)。图7为标准皂化法与快速皂化法的比较(n＝6)。具体实施方式以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本专利技术，不用于限制本专利技术。1、脂肪酶购于SIGMA公司，型号为L1754-100G，酶活为1229U/mg。实施例1：(1)标准溶液的制备标准储备溶液：准确称取0.0105g胆固醇标准品，正己烷溶解并定容至10.00mL，配制成1.00mg/mL标准溶液，保存于-18℃冰箱中。分别准确称取0.0104gα-生育酚标准品，0.0101gβ-生育酚标准品、0.0103gγ-生育酚标准品、0.0108gδ-生育酚标准品，分别用无水乙醇溶解并定容至10mL，分别得到1.00mg/mL的生育酚标准溶液，保存于-18℃冰箱中，备用。混合标准中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取乳粉中胆固醇和生育酚的预处理方法，其特征在于，所述方法是先采用脂肪酶酶解乳粉样品，再采用碳酸钾-无水乙醇溶液进行皂化处理，最后经萃取溶剂萃取得到胆固醇和生育酚混合溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种提取乳粉中胆固醇和生育酚的预处理方法，其特征在于，所述方法是先采用脂肪酶酶解乳粉样品，再采用碳酸钾-无水乙醇溶液进行皂化处理，最后经萃取溶剂萃取得到胆固醇和生育酚混合溶液。


2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述生育酚包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。


3.根据权利要求1或2所述的预处理方法，其特征在于，所述酶解条件为：脂肪酶添加量为100-150U/mg乳粉样品，pH为8.0-9.0，温度为30-40℃，酶解时间为2-10h。


4.根据权利要求1-3任一所述的预处理方法，其特征在于，所述碳酸钾-无水乙醇溶液与样品的用量比的(5-15)：1；碳酸钾-无水乙醇溶液中碳酸钾质量体积浓度为5％-10％。


5.根据权利要求1-4任一所述的预处理方法，其特征在于，所述皂化处理条件为：皂化温度为20-40℃，皂化时间为10-20min。


6.根据权利要求1-5任一所述的预处理方法，其特征在于，萃取溶剂为正己烷，乙酸乙酯，或石油...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢家溧，应璐，张书芬，李杨，郑睿行，承海，毛玲燕，
申请(专利权)人：宁波市食品检验检测研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33