本发明专利技术公开了一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒包含核酸提取液、2×Direct qRT‑PCR Mix、酶混合液、阴性对照，阳性对照以及引物和探针的混合物，其中所述的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ‑1)。本发明专利技术可实现在一个反应中同时对猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒进行快速鉴别检测，具有特异性高，稳定性好，操作简便的优点。不仅适用于科研单位定量分析，而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有较好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种用于猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒检测的试剂盒及其应用，特别涉及一种采用多重一步直扩实时荧光定量RT-PCR(探针法实时-定量聚合酶链反应)检测猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒的试剂盒，本专利技术还涉及该试剂盒的使用方法。属于分子生物学检测
技术介绍
非洲猪瘟(AfricanSwinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanSwinefevervirus，ASFV)引起的、以软蜱为传播媒介的猪的急性、热性、高度接触性传染病，以高热、皮肤发绀及淋巴结和内脏器官的严重出血为患病特征。非洲猪瘟传染性强、死亡率极高，缺少有效疫苗预防和治疗方法，一旦染病即会造成巨大的经济损失。非洲猪瘟虽名为“猪瘟”，但仅有“高热、严重出血”的症状与急性猪瘟相似。实际上，非洲猪瘟和猪瘟分别是由两种完全不同的病毒引起的传染性疾病。非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种单分子线状双链DNA病毒，属于双链DNA病毒目-非洲猪瘟病毒科-非洲猪瘟病毒属，也是ASFV家族中的唯一成员。它通过软蜱传播来感染野猪和家猪，主要在网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制，造成细胞凋亡，严重影响宿主的免疫系统，一旦发病即可致死。猪瘟(ClassicalSwinefever，CSF)俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科，猪瘟病毒属的RNA病毒—猪瘟病毒(ClassicalSwinefevervirus，CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。猪瘟与非洲猪瘟同样具有高度传染性和致死性，在自然条件下也只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。急性猪瘟发病特征与非洲猪瘟相似，呈败血性变化，表现为器官出血、坏死和梗死。猪瘟对于很多人并不陌生，1885年首次在美国发现，之后传播至世界各大洲。非洲猪瘟于1921年东非国家肯尼亚首次确认非洲猪瘟疫情，1957年传入欧洲，1971年传入美洲，2007年首次传播至欧亚接壤的格鲁吉亚，迅速传入俄罗斯，并在高加索地区定殖。2012年传入乌克兰，2013年传入白俄罗斯。2017年向东长距离跨越式传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克，2018年8月传入我国辽宁。这两种疫病的流行病学不同非洲猪瘟病毒是虫媒DNA病毒，除了接触传播外，软蜱是主要的传播媒介和贮存宿主，而猪瘟不通过软蜱传播，它是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病，猪是该病毒的自然宿主，猪瘟的传播主要是以接触传播为主。猪瘟与非洲猪瘟最大的不同点在于，猪瘟尚可采用疫苗防控，但目前还没有可用于预防非洲猪瘟的疫苗。至今ASFV的流行底细不明，还没有商品化的疫苗和诊断试剂可用，ASFV仍然处于失控状态，ASFV防控形式严峻。并且因临床发病症状与猪瘟相似，对猪瘟防控形成严重干扰。因此，建立一种鉴别诊断ASFV和CSFV的方法至关重要。常规的病原学诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测等，每种诊断方法都有其适用的范围。用常规病原学方法对血液、淋巴结等病毒含量低微的样品进行检测，往往得不到准确的结果。已有的RT-PCR检测方法只能进行定性检测不能做精确定量分析，且扩增后需要经过电泳分析，每次检测的样品数量较少、对低含量的样品不易检出。本专利技术针对目前的现状，在长期研究的基础上，建立并优化出一种简捷、廉价、敏感的Real-TimeRT-PCR鉴别检测ASFV和CSFV的检测方法，并组装成试剂盒。该方法无需体外使用核酸提取试剂盒提取核酸、无需反转录，在同一反应管内就可完成反转录和PCR的过程，通过荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，且无需电泳观察结果。大大缩短了时间和减少了污染的机率。本专利技术通过反复试验以及对引物浓度和探针浓度的优化，确定以下参数：(1)制作标准曲线的相关系数R2大于0.977；斜率位于-3--3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9-1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求；(2)35Cycles内可得到好的定量结果，符合灵敏度要求；(3)阴性对照35Cycles内无引物二聚体产生，符合阴性要求。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点，优于普通PCR方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感、准确及定量的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确以及定量地检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪瘟病毒(CSFV)的双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，在一个反应体系中即可完成ASFV和CSFV的核酸检测。为解决上述问题，本专利技术采用了下述技术方案：本专利技术一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述的试剂盒中包含核酸提取液、2×DirectqRT-PCRMix、酶混合液、阴性对照，阳性对照以及引物和探针的混合物，其中所述的引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示，所述的探针的核苷酸序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ-1)。其中，优选的，所述核酸提取液通过以下方法制备得到：将异硫氰酸胍25g溶于33mlCSB缓冲液中，混合至完全溶解；其中所述的CSB缓冲液中含有42mM柠檬酸钠、0.83％w/vN-laurylsarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)以及0.2mMβ-巯基乙醇。其中，优选的，所述SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示的引物和SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的探针的浓度均为10pmol/μL，引物及探针的摩尔比为1:1:1:1:1:1。其中，优选的，所述的阳性对照为含有SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示序列的质粒，所述阴性对照为无核酶水。其中，优选的，所述的阳性对照为含有SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示序列的pMD-18T质粒。其中，优选的，所述的试剂盒用于猪瘟和非洲猪瘟病毒检测时，按照以下步骤进行：a.使用本专利技术所述的试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR扩增，实时荧光定量RT-PCR总体系为50μl：2×DirectqRT-PCRMix：37μL；混合酶液:2μL；浓度均为10pmol/μl的引物和探针的混合液：6μL；实时荧光定量RT-PCR扩增条件为：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；b.结果分析；根据扩增结果判定：单独选取FAM，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix、酶混合液、阴性对照，阳性对照以及引物和探针的混合物，其中所述的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ-1)。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含核酸提取液、2×DirectqRT-PCRMix、酶混合液、阴性对照，阳性对照以及引物和探针的混合物，其中所述的引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示，所述的探针的核苷酸序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ-1)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液通过以下方法制备得到：
将异硫氰酸胍25g溶于33mlCSB缓冲液中，混合至完全溶解；其中所述的CSB缓冲液中含有42mM柠檬酸钠、0.83％w/vN-laurylsarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)以及0.2mMβ-巯基乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示的引物和SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的探针的浓度均为10pmol/μL，引物及探针的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，田宏，石正旺，罗俊聪，杨帆，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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