一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，包括以下步骤：提取样本总RNA；设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。本发明专利技术应用黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒特异引物可以同时在单PCR管中检测4种西番莲主要病毒，特异性、简便性、灵敏度和准确性较单一病毒或两种病毒检测有较大的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法
本专利技术属于检测
，进一步属于植物病毒学检测
，具体涉及一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法。
技术介绍
西番莲（PassifloraedulisL.）属于山茶亚目（Theoideae）西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（PassifloraL.），有530多个种（Munhozetal.,2018）。俗称百香果、激情果、番石榴、巴西果等，原产南美洲巴西和阿根廷。近年来作为国内水果市场的“新宠”，西番莲在中国台湾、福建、广东、广西、海南和云南等地区栽培推广，其商业化品种主要有紫果、黄果、黄果与紫果杂交品种等3大类，其中紫果品种在我国栽培面积最大。西番莲具有很高的营养价值，富含糖类、脂肪、蛋白质、维生素和矿质元素等物质。其果汁占鲜果重量的35%～38%，果皮占50%～55%，种子占5%～8%；干果皮中含果胶20%，粗纤维25%。西番莲果汁具有芒果、石榴、柠檬等多种水果的浓郁香味，风味独特，具有“果汁之王”的美称。西番莲生产种植过程中，真菌、细菌和病毒病害对其产质量造成重要影响。病毒病是西番莲生产上的第二大病害。目前已发现包括马铃薯Y病毒科、雀麦花叶病毒科、双生病毒科、芜菁黄花叶病毒科、乙型线状病毒科和帚状病毒科约20余种病毒可侵染西番莲。这些植物病毒病原侵染西番莲后，植株会表现出典型的病毒病症状，包括叶片花叶、黄化、小叶、畸形，果皮变厚变硬、着色异常，果肉少或无，植株矮化等，严重影响果树的产质量。通过茎尖剥离脱毒技术可以脱除种苗中大部分病毒，该方法被用于马铃薯、果树、花卉等多种无性繁殖的农经作物。随着种植户对西番莲种苗需求量爆发式增长，大量西番莲组培苗涌向市场，但其种苗带毒情况是不清楚的，为了明确脱毒种苗、田间植株以及环境中各种病原重要中间寄主的带毒情况，研究并应用一套准确、简便、灵敏、经济的检测方法用于种苗脱毒筛选和田间病原检测。根据前期对各地西番莲田间植株、种苗及组培苗等样品的检测，以下4种病毒是目前为害最严重、发生区域较广泛，检出率最为普遍的病毒病原。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法。本专利技术的目的是这样实现的，所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法包括以下步骤：A、提取样本总RNA；B、设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；C、在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；D、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；E、将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus,CMV）感染西番莲的黄瓜花叶病毒属病毒主要为该属典型代表种黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus,CMV），属于雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）。该病毒具有非常宽的寄主范围，可通过多种蚜虫以非持久方式传播侵染1000多种双子叶和单子叶植物，也可经汁液接触而机械传播，少数可由种子或者土壤传播。病毒粒子为等轴对称的二十面体，无包膜，三个组分的粒子大小一致，直径为28～30nm。病毒含有三个独立的RNA，即RNA1、RNA2、RNA3，每个RNA单独编码蛋白，其外壳蛋白由RNA3的亚基因组RNA4编码，通常还存在卫星RNA分子。Anon等首次报道CMV引起西番莲花叶病及果实木质化。我国先后在广东、福建、海南等西番莲病株上检测到CMV。西番莲木质化病毒（passionfruitwoodinessvirus，PWV）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）属于马铃薯Ｙ病毒科（Potyviridae），其病毒粒子为线状病毒，长度680～900nm，宽度12～15nm。病毒粒子为正单链RNA分子，大约10Kbp，编码一个多聚蛋白。该属病毒常引起花叶、皱缩、木质化，分布较广且造成严重经济损失。主要通过蚜虫非持久性非循环传播，此外病毒还可通过嫁接传播或刀具、剪刀类机械传播[7]。Potyvirus多种病毒可侵染西番莲，主要包括豇豆蚜传花叶病毒(Cow-peaaphid-bornemosaicvirus，CABMV)、西番莲环斑病毒(Passionfruitringspotvirus，PFRSV)、菜豆黄花叶病毒(Beanyellowmosaicvirus，BYMV)、西番莲斑驳病毒(Passionfruitmottlevirus，PaMV)、大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)、西番莲Y病毒(PassifloravirusY，PaVY)、马来西亚西番莲病毒(MalaysianPassifloravirus，MPV)、夜来香花叶病毒(Telosmamosaicvirus，TeMV)。西番莲木质化病毒（passionfruitwoodinessvirus，PWV）属于Potyvirus成员，其引起西番莲木质化病，目前该病害是西番莲生产中为害最大的病毒性病害之一。感病植株典型症状为整株长势弱小，叶片扭曲、皱缩、花叶，有时会伴随瘤状突起。果实木质化，果皮变厚。该病于1901年首次报道于澳大利亚，随后陆续报道于巴西、南非、日本、中国和乌干达等国，1973年证实为病毒侵染引起的病害。该病毒种下单元存在不同株系分化。根据不同寄主症状反应，可分为PWV-TB、PWV-S强毒株和PWV-M弱毒株。澳大利亚最早发现侵染西番莲的马铃薯Y病毒属病毒——西番莲木质化病毒(Passiflorawoodinessvirus,PWV)，但PWV不造成花叶。夜来香花叶病毒（Telosmamosaicvirus,TeMV）夜来香花叶病毒（Telosmamosaicvirus,TeMV）也属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员。2014年，在泰国首次发现田间种植的西番莲上出现类似病毒病症状，叶片表现不同程度的花叶，果形变小，果皮皱缩，着色异常，失去经济价值。感病植株组织内可观察到典型曲线状类马铃薯Ｙ病毒属病毒粒体结构，细胞质中可观察到病毒内涵体。经过CP基因及蛋白序列一致性比对发现，该病毒与在越南发现夜来香上的夜来香花叶病毒（Telosmamosaicvirus,TeMV）具有最高的同源性，因此确定为TeMV的一个株系。目前，通过症状观察、血清学检测、电镜观察，我国广西西番莲产区也有夜来香花叶病毒。芜菁花叶病毒（Turnipmosaicvirus,TuMV）芜菁花叶病毒（Turnipmosaicvirus,TuMV）也属于马铃薯Y病毒属成员（Potyvirus），是危害蔬菜最严重的5种病毒之一，寄主范围非常广泛，可侵染43科156属的300多种植物。被侵染的植株初期表现为花叶、明脉、皱缩，后期出现矮化、畸形等症状，严重影响作物的产量和品质。自然状态本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，其特征在于所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法包括以下步骤：/nA、提取样本总RNA；/nB、设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；/nC、在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；/nD、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；/nE、将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，其特征在于所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法包括以下步骤：
A、提取样本总RNA；
B、设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；
C、在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；
D、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；
E、将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。


2.根据权利要求1所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，其特征在于所述的提取样本总RNA是取新鲜或低温保存待测样品50~150mg，应用Trizol试剂1~1.5ml，提取植物总RNA，溶解于20~30μlDEPC处理的灭菌水中，-80℃下保存备用。


3.根据权利要求1所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，其特征在于所述的用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物如下：
1）黄瓜花叶病毒特异引物：
CMV-312F：5′-GGTCGTATTGCTTCCTTCT-3′；
CMV-1050R：5′-GATGTCTACTGTATCAACTCAC-3′；
2）芜菁花叶病毒特异引物：
TuMV-8229F：5′-GCGACAGCATCATCAGAT-3′；
TuMV-88...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁铭，钟静，李婷婷，赵丽玲，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53