一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。消化道腺病毒主要包括人类腺病毒40型和41型，该试剂盒针对人类腺病毒40型和41型设计特异性引物和探针以及PCR反应体系，其中特异性引物和探针由人类腺病毒40型及41型全基因组的共同序列、内参片段的特异性引物和探针组成。该试剂盒能精准检测到40型及41型的人类腺病毒，且不会受到其它非40型、41型人类腺病毒及其它微生物的序列影响，实现高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题，同时本发明专利技术采用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数，寻找最佳靶序列，使检测效率、精准度大大提高。

【技术实现步骤摘要】
一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用。
技术介绍
腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。衣壳内部为线状双链DNA分子，自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人类腺病毒有52种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。消化道腺病毒属于F亚群，且以40和41两个型别为主。人类腺病毒可诱发多种感染，包括呼吸道感染、眼部感染、消化道感染等。许多人类腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出。大多血清型与胃肠道疾病无关，但人类腺病毒40型和41型可致病，是引起婴幼儿与年少儿童(4岁以下)的胃肠炎，致腹痛、腹泻的主要原因。消化道腺病毒的常用鉴定方法如下：(1)培养：病毒株培养特异性较高，是获得病毒株并进行流行病学调查所必需的，技术要求高，操作复杂，临床实验室普遍没有开展；(2)酶联免疫试验检测细胞毒素抗体：间接反映感染状况，检测病毒抗体快速，方法重复性差、敏感性低、特异性不强；(3)胶体金法检测细胞毒素的抗原：敏感性低和重复性差，特异性较好。由于上述的实验室检查方法分别有敏感性差，特异性低，检测周期长，设备要求高，重复性差等缺点，使检查结果经常出现假阳性或假阴性，导致误诊、漏诊。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒，该试剂盒可特异、敏感、准确、快速地检测粪便样本中的消化道腺病毒。为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：利用自主研发的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载人类腺病毒40型及41型的参照序列(40型GenBank：KU162869.1，序列长度34,210bp；41型GenBank：KY316161.1，序列全长34,198bp)。以此参照序列为模板，建立候选短片段文库、片段特异性和敏感性评估、引物设计、引物性能评估、临床样本验证等，在此基础上开发出一种敏感性高、特异性强、成本低、检测通量更大的消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒。基因是识别生物物种的名片，寻找特异而保守的基因序列如同大海捞针，是决定试剂盒特异性、敏感性的关键。本专利技术的创新之处在于：1)此试剂盒能精准检测到不同血清型的消化道腺病毒，且不会受到其他非消化道腺病毒(特别是呼吸道腺病毒)以及其它微生物的序列影响，实现高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题；2)本专利技术所采用的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，可以对数千万碱基对的全基因组序列进行全面筛查，找到几十个至几百个特异保守序列，再根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数二次筛查，优中选优，找到最佳靶序列，使检测效率、特异性、敏感性相比于常规设计方法提高10倍。本专利技术专利中的引物设计方法采用自主研发的鸬鹚大数据挖掘系统，在消化道腺病毒全基因组(长度约34000bp)范围内搜寻最优的引物和探针片段，相比传统方法只针对Hexon基因(约3000bp)设计引物，扩大了搜索范围10倍以上，而且所用时间较短，效率更高。本专利技术所述消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒包括反应液A与反应液B，反应液A包括两对引物和两个探针：人类腺病毒40型及41型的特异性引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及对应的FAM标记的探针SEQIDNO.3；内参片段引物对SEQIDNO.4和SEQIDNO.5以及对应的HEX标记的探针SEQIDNO.6。其中HEX、FAM为荧光基团，TAMRA为淬灭基团。反应液B包括热启动酶和UNG酶。本专利技术所述消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒中使用的阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为克隆人类腺病毒40型及41型的目的基因序列的工程菌悬液。内参片段的DNA序列SEQIDNO.7如下所示：5’-TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGTCTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAAGAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTGAAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG-3’；引物与探针的组合如下：目的片段的上游引物SEQIDNO.1：5’-TTCACCTCTGTTTGCTGCAC-3’；目的片段的下游引物SEQIDNO.2：5’-AGGTAGTCCGCAGTTTGGAA-3’；目的片段的探针SEQIDNO.3：5’-FAM-TGCCATCTGCAGCATTGCCACT-TAMRA-3’；内参片段的上游引物SEQIDNO.4：5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’；内参片段的下游引物SEQIDNO.5：5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’；内参片段的探针SEQIDNO.6：5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。利用上述两对引物和探针可同时针对40型及41型人类腺病毒的特异目的片段和内参片段进行双重荧光PCR扩增。本专利技术还提供了该试剂盒的应用，包括如下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)进行PCR扩增：以待测样品DNA为模板，按一定比例加入PCR反应液A和PCR反应液B，其中反应液A包括12.5mMTris-HCl,pH9.0、50mMKCl、0.13％X-100、3.13mMMgCl2、0.45mMdATP、0.45mMdGTP、0.45mMdCTP、0.79mMdUTP、两对引物SEQIDNO.1和2、4和5，浓度都为0.3-0.7μM，两个探针SEQIDNO.3、6，浓度都为0.14-0.16μM；反应液B包括20mMTris-HCl、100mMKCl、0.1mMEDTA、1mMDTT、50％Glycerine、0.5％20、1-3U/μL热启动酶、0.1-0.3U/μLUNG酶，进行PCR扩增，同时以阴性质控品、阳性质控品代替待测样品DNA，作为模板，加入PCR反应液A和PCR反应液B，进行阴性质控品和阳性质控品的PCR扩增；(3)根据Ct值进行结果判定。进一步的，所述步骤(2)中，反应液A中含有两对引物SEQIDNO.1和2、4和5，浓度都为0.5μM，两个探针SEQIDNO.3、6，浓度都为0.15μM；PCR反应液B含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒，包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针是由人类腺病毒40型及41型全基因组的共同序列和内参片段的特异性引物和探针组成，其特征在于，所述特异性引物和探针序列如下：/n目的片段的上游引物SEQ ID NO.1：5’-TTCACCTCTGTTTGCTGCAC-3’；/n目的片段的下游引物SEQ ID NO.2：5’-AGGTAGTCCGCAGTTTGGAA-3’；/n目的片段的探针SEQ ID NO.3：/n5’-FAM-TGCCATCTGCAGCATTGCCACT-TAMRA-3’；/n内参片段的上游引物SEQ ID NO.4：5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’；/n内参片段的下游引物SEQ ID NO.5：5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’；/n内参片段的探针SEQ ID NO.6：/n5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒，包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针是由人类腺病毒40型及41型全基因组的共同序列和内参片段的特异性引物和探针组成，其特征在于，所述特异性引物和探针序列如下：
目的片段的上游引物SEQIDNO.1：5’-TTCACCTCTGTTTGCTGCAC-3’；
目的片段的下游引物SEQIDNO.2：5’-AGGTAGTCCGCAGTTTGGAA-3’；
目的片段的探针SEQIDNO.3：
5’-FAM-TGCCATCTGCAGCATTGCCACT-TAMRA-3’；
内参片段的上游引物SEQIDNO.4：5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’；
内参片段的下游引物SEQIDNO.5：5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’；
内参片段的探针SEQIDNO.6：
5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。


2.如权利要求1所述的消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)进行PCR扩增：以待测样品DNA为模板，按一定比例加入PCR反应液A和PCR反应液B，其中反应液A包括12.5mMTris-HCl,pH9.0、50mMKCl、0.13％X-100、3.13mMMgCl2、0.45mMdATP、0.45mMdGTP、0.45mM...

【专利技术属性】
技术研发人员：马东礼，刘孝荣，邢志浩，姜含芳，邓栩文，
申请(专利权)人：深圳市儿童医院，
类型：发明
国别省市：广东;44