本发明专利技术公开了一种用于新型冠状病毒检测的逆转录实时荧光定量环介导等温扩增试剂盒及其使用方法。所述试剂盒，由新型冠状病毒核衣壳(N)基因环介导等温扩增引物组构成，试剂盒成分主要由新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组溶液、环介导等温扩增反应预混液、AMV逆转录酶、新冠病毒N基因阳性质控品构成，可采用逆转录实时荧光检测方法，进行新冠病毒的快速检测。本方法在30分钟之内可以完成检测，特异性强，灵敏度高，为新型冠状病毒的防控及流行趋势调查分析提供了一种简便、快速的途径。
【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法
本专利技术涉及一套用于病毒快速检测的引物组、试剂盒及使用方法，尤其涉及一套用于检测新型冠状病毒（简称新冠病毒）环介导等温扩增引物组、试剂盒及其使用方法，属于新冠病毒检测领域。
技术介绍
新冠病毒在分类学上属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征，基因组为线性单股正链的ＲNA病毒。该病毒基因组包含两个位于侧翼的非编码区(5'-UTＲ和3'-UTＲ)、由12个开放阅读框(orf1ab，Spike，orf3a，orf3b，E，M，orf6，orf7a，orf7b，orf8/orf8b，N和orf9b)组成的一个编码多蛋白开放阅读框、1个前导序列、9个转录调控序列组成。其基因组的排列顺序为5'-复制酶(orf1/ab)-结构蛋白［Spike(S)Envelope(E)-Membrane(M)-Nucleocapsid(N)］3'，其编码产物依次是复制酶(orf1/ab)、刺突糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳(N)及其它假想蛋白，但缺乏在β类型冠状病毒A系中所特有的血凝素脂酶(HE)基因。目前，新冠病毒的临床检测方法主要为实时荧光定量RT-PCR检测。然而，由于荧光定量RT-PCR反应对温度具有一定的依赖性，要求精密控温系统，检测时间长，实验成本高，不适于现场快速检测，面对新冠病毒的世界范围大规模流行，急需开发快速检测方法。环介导等温扩增（LAMP）法是2000年由日本Notomi博士专利技术的一种新的核酸扩增技术，更具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。经过二十年的发展，该方法得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测以及床旁检测。目前，新冠病毒的临床检测方法主要为实时荧光定量RT-PCR检测。然而，由于荧光定量RT-PCR反应对温度具有一定的依赖性，要求精密控温系统，检测时间长，实验成本高，不适于现场快速检测，面对新冠病毒的世界范围大规模流行，急需开发快速检测方法。环介导等温扩增（LAMP）法是2000年由日本Notomi博士专利技术的一种新的核酸扩增技术，更具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。经过二十年的发展，该方法得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测以及床旁检测。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一套用于新冠病毒快速检测的环介导等温扩增试剂盒。所述新冠病毒环介导等温扩增引物组是针对SARS-CoV-2核衣壳(N)基因特异性序列所设计。其中，N基因引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，按一定的比例配制而成，其中内引物与外引物按2:1，4:1，8:1，16:1的比例配制，优选比例为8:1，环引物与内引物的比例为1:2，反应终浓度外引物、内引物、环引物分别为：0.2μM、1.6μM、0.8μM。所述的环介导等温扩增反应预混液，可以是使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒IsothermalMasterMix（英国，OptiGene公司）或者等效的其他试剂盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO4和缓冲溶液组成。试剂盒中还同时引入新冠病毒N基因阳性质控品，是由涵盖引物组扩增的N基因区域人工合成片段构建的质粒经体外转录纯化后得到的RNA模板。所述新冠病毒N基因环介导等温扩增反应体系的总体积为25μL，其中包括N基因环介导等温扩增引物组溶液6μL，环介导等温扩增反应预混液13.8μL，AMV逆转录酶0.2μL，待测试样或者阳性质控品5μL。经扩增温度在60-67℃范围内的优选结果，最适扩增温度为64℃。环介导等温扩增荧光检测系统的扩增程序为：64℃，30min，98℃-80℃，0.05℃/s，10min。所述新冠病毒N基因检测试剂盒，实时荧光检测法中每个反应荧光信号达最大值所对应的扩增时间（Peaktime）与体外转录RNA模板初始拷贝数的对数值之间，在102拷贝/反应-107拷贝/反应范围内具有线性关系，R2>0.970，可根据该标准曲线进行待测样本模板拷贝数的测定；该方法待测样本模板RNA拷贝数的检出限为102拷贝/反应。扩增结果的分析和判定方法包括：1）环介导等温扩增荧光检测系统测得的扩增曲线出现平台时，其荧光值高于本底噪音信号5倍且溶解曲线为单一尖锐峰的判定为阳性结果，其荧光值高于本底噪音信号5倍但溶解曲线不是单一尖锐峰的判定为非特异性的交叉干扰信号；其荧光值低于或等于本底噪音信号5倍的判定为阴性结果；2）当待测试样新冠病毒N基因环介导等温扩增反应管为阴性结果时，则未检测到新冠病毒；待测试样为阳性结果，则为新冠病毒感染；其特征在于，N基因的扩增曲线以30min时的读数为基准。一种用于新冠病毒SARS-CoV-2诊断的环介导等温扩增试剂盒的使用方法，还包括荧光信号达到最大值所对应的扩增时间（Peaktime）与模板初始拷贝数的量化关系分析。其方法为，分别配制浓度分别为107拷贝数/反应、106拷贝数/反应、105拷贝数/反应、104拷贝数/反应、103拷贝数/反应、102拷贝数/反应的N基因阳性质控品水溶液系列，用逆转录环介导等温扩增实时荧光检测系统分别测定阳性质控品水溶液系列，以反应Peaktime为纵坐标，以体外转录RNA模板初始拷贝数对数值（Log(Copies/reaction)）为横坐标，建立关系曲线。利用该曲线，通过测定未知样品Peaktime，即可测得待测样品内目标模板的初始拷贝数。附图说明图1新冠病毒N基因体外转录RNA阳性质控品纯度及完整性图2优化反应条件—引物浓度图3优化反应条件—扩增温度图4逆转录环介导等温扩增实时荧光检测法新冠病毒N基因引物特异性实验结果。图中，1的模板为新冠病毒N基因体外转录RNA，2的模板为MERS-CoV体外转录RNA，3的模板为SARS-CoV体外转录RNA，4的模板为甲型流感病毒A/上海普陀/1203/2013(H1N1pdm09)RNA，5的模板为甲型流感病毒A/杭州/1/2013(H7N9)RNA，6的模板为甲型流感病毒A/环境/江西/21/2011（H9N2）RNA，7的模板为B/北京海淀/1386/2013（Victoria）RNA，8的模板为乙型流感病毒B/重庆渝中/1361/2013（Yamagata）RNA（1-3模板为实验室自行构建，4-8模板由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所馈赠)。图5逆转录环介导等温扩增实时荧光检测法新冠病毒N基因灵敏度实验结果。图中，1为配制浓度108拷贝数/反应、2为配制浓度107拷贝数/反应、3为配制浓度106拷贝数/反应、4为配制浓度105拷贝数/反应、5为配制浓度104拷贝数/反应、6为配制本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一套用于检测新型冠状病毒（简称新冠病毒）的环介导等温扩增引物组，由新冠病毒核衣壳(N)基因环介导等温扩增引物组构成，其特征在于，可用于新冠病毒检测的环介导等温扩增反应；/n所述新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，由一对外引物（SEQ No.1、SEQ No.2）、一对内引物（SEQ No.3、SEQ No.4）和一对环引物（SEQ No.5、SEQ No.6）组成，其引物序列为：/n
【技术特征摘要】
1.一套用于检测新型冠状病毒（简称新冠病毒）的环介导等温扩增引物组，由新冠病毒核衣壳(N)基因环介导等温扩增引物组构成，其特征在于，可用于新冠病毒检测的环介导等温扩增反应；
所述新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，由一对外引物（SEQNo.1、SEQNo.2）、一对内引物（SEQNo.3、SEQNo.4）和一对环引物（SEQNo.5、SEQNo.6）组成，其引物序列为：
引物名称
引物序列（5’-3’）
SEQNo.1
TTATACAGTTTCCTGTTTACCTT
SEQNo.2
TACTGCCAGTTGAATCTGA
SEQNo.3
ACACGAACGTCATGATACTCTAAAATTGCCAGGAACCTAAATTGG
SEQNo.4
ACTAAAATGTCTGATAATGGACCCCGGGTCCACCAAACGTAAT
SEQNo.5
CGAACAACGCACTACAAGACTAC
SEQNo.6
AGCGAAATGCACCCCGC
。
2.一种如权利要求1所述的新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组，用于新冠病毒检测试剂盒，主要由新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组溶液、环介导等温扩增反应预混液、AMV逆转录酶、新冠病毒N基因阳性质控品构成，其特征在于，可以采用逆转录实时荧光检测方法，进行新冠病毒的快速检测；
所述新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组溶液，其特征在于，是由一对内引物、一对外引物和一对环引物按一定的比例配制而成，其中内引物与外引物按2:1，4:1，8:1，16:1的比例配制，优选比例为8:1，环引物与内引物的比例为1:2，反应终浓度外引物、内引物、环引物分别为：0.2μM、1.6μM、0.8μM；
所述环介导等温扩增反应预混液，其特征在于，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO4和缓冲溶液等构...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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