一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，公开了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT‑RAA检测试剂盒，包括：上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示；探针，序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的试剂盒具有98.39%的正确率，特异度达98.95%，每反应检测灵敏度在95%的概率下达到241copies/反应，可实现在39℃等温条件下25分钟内完成新型布尼亚病毒的检测，具有操作简便、快速、灵敏、适用于现场快速检测的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒
本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测体系。
技术介绍
发热伴血小板减少综合征(severefeverwiththrombocytopeniasyndrome，SFTS)是一种由新型布尼亚病毒(severefeverwiththrombocytopeniasyndrome，SFTSV)感染引起的严重的传染性疾病，临床表现主要有发热、血小板减少、白细胞减少、胃肠道症状和肝功能异常，病死率高达6.4-30％。SFTSV属于布尼亚病毒科(Banyangvirus)，白蛉病毒属(Phenuiviridae)，可感染人、动物和蜱等多种宿主，目前认为长角牛蜱是主要的传播载体。我国的流行地区主要为东部、中部省份的山地、丘陵地区。自2009年SFTSV在我国被首次分离鉴定后，我国的SFTS病例数逐年上升，在韩国、日本、美国等全世界多个国家也相继有病例被报道。近年多项研究发现SFTS可通过密切接触或气溶胶进行人间传播。因此，SFTS已成为一个严重的公共卫生问题。现阶段对SFTSV的实验室检测方法主要病毒分离鉴定、血清抗体检测和病毒核酸检测。病毒分离鉴定：需要采集早期SFTS患者急性期血清标本，体外接种VeroE6细胞，通过显微镜或分子生物学手段对接种效果进行确认。分离得到SFTSV是诊断SFTS最有力的病原学证据，但相关实验操作须专业技术人员在III级生物安全实验室进行，且耗时1-2周，不适用于临床实验室检测和现场快速检测。血清抗体检测：通过血清中和试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血清中的新型布尼亚病毒IgM、IgG抗体。血清中和试验耗时较长，且成本较高，不常用于临床实验室检测。ELISA检测抗体的敏感度较高，操作较为简便、快速。但是对新型布尼亚病毒IgM抗体的研究发现部分患者急性期IgM抗体可呈阴性，恢复期转阳；而对IgG抗体的检测需要患者急性期、恢复期双份血清标本，不适用于现场快速检测。病毒核酸检测：目前已有多种检测患者血清中SFTSVRNA的方法，临床常用的包括逆转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等方法，均具有高灵敏度和特异度。基于PCR的检测通常需要精密昂贵的仪器和专业检测人员来避免污染对检测结果的影响；RT-LAMP敏感性很高，但需要4-6条引物，增加了引物设计的难度和复杂性，且存在一定的假阳性率，影响其作为现场诊断技术的应用。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒，具有98.39％的正确率，特异度达98.95％，每反应检测灵敏度在95％的概率下达到241copies/反应，可实现在39℃等温条件下25分钟内完成新型布尼亚病毒的检测，具有操作简便、快速、灵敏、适用于现场快速检测的特点。本专利技术的具体技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测特异性引物，包括：上游引物，序列如SEQIDNO：1所示：ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；下游引物，序列如SEQIDNO：2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC。第二方面，本专利技术提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测探针，序列如SEQIDNO：3所示：AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3Spacer]；其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3Spacer为3‘端间臂。第三方面，本专利技术提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒，包括：上游引物，序列如SEQIDNO：1所示：ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；下游引物，序列如SEQIDNO：2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC；探针，序列如SEQIDNO：3所示：AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3Spacer]；其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3Spacer为3‘端间臂。根据GenBank中收录的新型布尼亚病毒参考序列(收录号NC_043452.1，NC_043451.1，NC_043450.1)，使用CD-Search(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)筛选保守区域，并将筛选所得高度保守序列，与GenBank中收录的新型布尼亚病毒序列运用BLAST对该序列的同源性进行验证，根据该高度保守序列进行实时荧光RT-RAA检测引物、探针的设计及筛选。本专利技术团队通过经验总结发现RAA技术对于引物设计的要求与常规PCR有所不同，要求寡核苷酸引物长度在30-35核苷酸(nt)之间；序列中避免回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；5’端前3-5nt避免重复鸟嘌呤核苷酸(G)序列；目标片段长度小于500碱基对；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；通过试验优化筛选出最佳引物对。此外，实时荧光RT-RAA技术还需要一条寡核苷酸探针。探针设计要求序列不与特异性引物识别位点重叠；长度为46-52nt；序列中避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。还要求对探针的四个位点进行修饰：将距离5’端＞30nt处的核苷酸替换为一个四氢呋喃(THF)，作为核酸外切酶的识别位点，THF距离3’端＞15nt；对THF位点上游的一个胸腺嘧啶核苷酸(T)标记荧光基团，THF位点下游的一个T标记淬灭基闭，两个基团的间距为2-4nt；并对探针3’端进行间臂修饰以阻断聚合酶的DNA链合成。根据以上引物和探针设计要求，以筛选所得L片段高度保守序列作为目标基因片段进行上、下游引物及探针设计，各设计序列如下：上游引物：RAA-S1：5′-ATAAGATCAATCATGATTTCACGTTTTCTGGC-3′；SEQIDNO：4RAA-S2：5′-ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG-3′；SEQIDNO：1RAA-S3：5′-GGTTGATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTAT-3′；SEQIDNO：5下游引物：RAA-AS1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测特异性引物，其特征在于包括：/n上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示：/nATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；/n下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测特异性引物，其特征在于包括：
上游引物，序列如SEQIDNO:1所示：
ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；
下游引物，序列如SEQIDNO:2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC。


2.一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测探针，其特征在于，序列如SEQIDNO:3所示：AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3Spacer]；
其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3Spacer为3‘端间臂。


3.一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒，其特征在于包括：
上游引物，序列如SEQIDNO:1所示：
ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；
下游引物，序列如SEQIDNO:2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC；
探针，序列如SEQIDNO:3所示：
AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3Spacer]；其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3Spacer为3‘端间臂。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

【专利技术属性】
技术研发人员：李世波，付永锋，王秋景，程训佳，周晶雨，戚婉君，朱立君，张浙恩，
申请(专利权)人：舟山医院，复旦大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33