本发明专利技术公开了一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT‑LAMP试剂盒及其专用引物和应用，属于生物技术检测领域。提供的用于检测黄热病毒疫苗株的RT‑LAMP引物能够实现对黄热病毒疫苗株的特异性检测和鉴别，提供的RT‑LAMP试剂盒的检测操作简单、特异性强、灵敏度高，可以快速且高效对黄热病毒疫苗株进行检测和鉴别，可以用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和鉴别黄热病毒疫苗株。
【技术实现步骤摘要】
用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和应用
本专利技术属于生物
中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测专用引物和检测试剂盒。
技术介绍
黄热病毒(Yellowfevervirus)是黄病毒科(Flaviridae)，黄病毒属(Flavivirus)的单股正链RNA病毒。病毒经蚊虫传播，传播媒介主要为埃及伊蚊，临床特征有发热、剧烈头痛、黄疸、出血和蛋白尿等，目前主要在非洲及南美洲流行。人群对黄热病毒疫苗株较为易感，病死率可达20％-40％，是国际三大检疫传染病之一，目前通过接种黄热病毒减毒活疫苗来控制黄热病的流行。目前使用的疫苗株为Theiler和Smith在1936年减毒的Asibi株，命名为17D株，并在17D株的基础上进一步传代减毒，衍生出现代生产黄热疫苗所使用的17D-204(欧美国家使用)，17D-213和17DD疫苗株(巴西使用)。黄热减毒疫苗已为世界大面积人群提供了近50年的保护力，是疫苗史上最安全有效的减毒活疫苗之一。虽然目前我国未见有黄热病的大规模流行，但我国某些地区的地理条件和气候条件与黄热病高发区域相似，也存在发病的可能性。在过去的20多年里，黄热病感染者逐年增加，据世界卫生组织(WHO)估计，每年至少有20万黄热病病例，造成3万人死亡，严重威胁到人们的健康。目前，黄热病毒减毒疫苗已在世界范围内大量使用，因此在检疫口岸，需要结合黄热病毒的检测以及黄热病毒疫苗株的鉴定，以快速判断该病毒是否为输入性感染病例或是否为新感染病例，及时对感染病例采取相应的处置措施，可将外来感染阻挡于国门之外。因此需要建立黄热病毒疫苗株的快速、灵敏检测鉴别方法，以快速区分是否为输入性感染病例或新感染病例，能够尽早对疑似病例做出正确的实验室诊断，对有效指导后续的疫情处理与防控工作具有极其重要的意义。目前病毒疫苗株的鉴别检测方法主要为利用PT-PCR及Real-timeRT-PCR的核酸检测方法，该方法需要特殊仪器，一些设备条件相对简陋的基层单位或检疫口岸无法进行。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术的一个方面提供一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP引物组，包括序列表中SEQIDNO:2所示的引物F3、SEQIDNO:3所示的引物B3、SEQIDNO:4所示的引物FIP、SEQIDNO:5所示的引物BIP、SEQIDNO:6所示的引物LF和SEQIDNO:7所示的引物LB。本专利技术另一方面提供一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒，包含上述的RT-LAMP引物组。上述RT-LAMP引物组在25μL反应体系中的使用浓度为：引物F3和B3的终浓度独立地为2～8pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为24～36pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为10～16pmol。上述引物F3和B3的终浓度独立地为4pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为32pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为12pmol。上述RT-LAMP试剂盒中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×ThermopolReactionBuffer、100mMMgSO4、5mMbetaine、10mMdNTP、8UBstDNApolymerase和7.5UWarmStartRTxreversetranscriptase。上述基础反应试剂在25μL反应体系中的使用量分别为：10×ThermopolReactionBuffer2.5μl、100mMMgSO41.5μl、5mMbetaine4μl、10mMdNTP3.5μl，BstDNApolymerase1μl，WarmStartRTxreversetranscriptase0.5μl。上述RT-LAMP试剂盒还包含阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包含黄热病毒疫苗株基因组RNA，所述阴性对照为不含黄热病毒疫苗株基因组RNA的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。上述的RT-LAMP引物组在制备用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂中的应用也属于本专利技术的内容，该应用采用上述的RT-LAMP试剂盒检测黄热病毒疫苗株，包括以下步骤：S1：提取待测样品RNA；S2：反应体系配制：25μL反应体系包含2μL待测样品RNA、10×ThermopolReactionBuffer2.5μl、100mMMgSO41.5μl、5mMbetaine4μl、10mMdNTP3.5μl，8UBstDNApolymerase1μl，7.5UWarmStartRTxreversetranscriptase0.5μl，引物加入量为：100μMFIP/BIP引物各0.8μl，100μMLF/LB引物各0.3μl，100μMF3/B3所示引物各0.1μl，ddH2O补至25μl；S3：将反应体系置63℃-65℃条件下恒温扩增反应45-60min，获得反应液；S4：结果分析：使用钙黄绿素颜色指示剂或浊度仪对所述反应液进行检测分析。上述步骤S3中将反应体系置65℃条件下恒温扩增反应50min。上述步骤S4中所述结果分析的具体方法为：当使用钙黄绿素颜色指示剂进行检测时，在反应液中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂，呈现绿色表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，呈现橙色表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)；当使用浊度仪进行检测时，浊度上升(>0.1)表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)。基于以上技术方案提供的用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂盒及其专用引物能够实现高效、快速、高特异性地检测黄热病毒疫苗株的目的，且操作简单，灵敏度高，结果鉴定简便，与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1)通过设计并筛选获得的引物可以对黄热病毒疫苗株的特有序列进行特异性识别，保证了RT-LAMP扩增的高度特异性；2)本专利技术具有灵敏度高等特点，检测最低限达到9.46pg/μl；3)本专利技术操作简便、快速且高效，只需将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果，因此不需要大型仪器设备和专业人员，更加适用于基层检测；4)本专利技术结果鉴定简便，可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；综上所述，本专利技术可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到黄热病毒疫苗株，不需要复杂仪器，为黄热病毒疫苗株的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测黄热病毒疫苗株，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。附图说明图1为用于检测黄热病毒疫苗株的引物筛选曲线；图2为用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测方法的反应温度的筛选曲线；图3为用于黄热病本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP引物组，其特征在于，包括序列表中SEQ IDNO:2所示的引物F3、SEQ ID NO:3所示的引物B3、SEQ ID NO:4所示的引物FIP、SEQ ID NO:5所示的引物BIP、SEQ ID NO:6所示的引物LF和SEQ ID NO:7所示的引物LB。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP引物组，其特征在于，包括序列表中SEQIDNO:2所示的引物F3、SEQIDNO:3所示的引物B3、SEQIDNO:4所示的引物FIP、SEQIDNO:5所示的引物BIP、SEQIDNO:6所示的引物LF和SEQIDNO:7所示的引物LB。
2.一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的RT-LAMP引物组。
3.根据权利要求2所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP引物组在25μL反应体系中的使用浓度为：引物F3和B3的终浓度独立地为2～8pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为24～36pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为10～16pmol。
4.根据权利要求3所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物F3和B3的终浓度独立地为4pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为32pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为12pmol。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP试剂盒中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×ThermopolReactionBuffer、100mMMgSO4、5mMbetaine、10mMdNTP、8UBstDNApolymerase和7.5UWarmStartRTxreversetranscriptase。
6.根据权利要求5所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述基础反应试剂在25μL反应体系中的使用量分别为：10×ThermopolReactionBuffer2.5μl、100mMMgSO41.5μl、5mMbetaine4μl、10mMdNTP3.5μl，BstDNApolymerase1μl，WarmStartRTxreversetranscriptase0.5μl。
7....
【专利技术属性】
技术研发人员：袁静，蒋栋，刘翟，陈晨，闫超，薛冠华，马莉萍，曾辉，
申请(专利权)人：首都儿科研究所，中国科学院武汉病毒研究所，首都医科大学附属北京地坛医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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