本发明专利技术公开了鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引物对和探针、试剂盒及其应用。本发明专利技术筛选获得特异性好的2条探针和1对特异性引物，使用一步法扩增试剂进行扩增，建立了一种可快速鉴别诊断PEDV疫苗株与流行毒株的荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，只扩增猪流行性腹泻病毒疫苗株和流行株，而对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒均无非特异性扩增，保证检测结果的准确性。本发明专利技术所建立的检测试剂盒具有较高灵敏度和特异性，同时具有较好的批内和批间检测的稳定性和准确性，可以实现PEDV毒株类型精准鉴定，符合检测标准，能广泛应用于PEDV临床监测和疾病诊断。
【技术实现步骤摘要】
鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及应用
本专利技术涉及猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的鉴定，本专利技术进一步涉及鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株PCR引物对和探针以及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，属于猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的分子鉴定领域。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的一种以仔猪急性腹泻为临床特征的高度接触性传染病。PEDV为冠状病毒科，α冠状病毒属成员，有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长28kb，有七个开放阅读框，编码4个结构蛋白(S、E、M和N)和3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)，其中S基因编码的的纤突蛋白是PEDV重要组成部分，其于中和抗体产生、病毒感染和受体融合等密切相关，也是当前致病机制研究、诊断试剂及疫苗研发的重要蛋白。PEDV自1971年爆发即给世界养猪业造成巨大经济损失，2010年PEDV在中国再次大规模爆发，此次流行毒株与当前使用的疫苗株在S基因发生多处碱基的插入与缺失，并伴有大量点突变。时至今日PEDV已成为我国90％猪场的头号疫病，因此开展PEDV的检测和精准鉴定是防控重要措施之一。然而，由于可引起猪群消化道疾病的病原较多且临床症状基本相似，很难从临床症状诊断得以区分病原类型，因此建立有效的PEDV实验室和临床检测方法势在必行。当前针对PEDV检测方法有RT-PCR、ELISA、IFA和RT-LAMP等检测方法，但是这些方法较难实现准确快速的检测诊断，同时也很难对当前猪场的疫苗株和流行毒株进行精准鉴定。因此基于OIE和国内认可的荧光定量PCR检测方法为基础，建立多重荧光定量RT-PCRPEDV检测方法具有较好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种鉴定猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引物对和探针；本专利技术的目的之二是提供一种鉴定猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术根据猪流行性腹泻病毒疫苗毒株与流行毒株在S基因N端多处碱基的差异，分别设计了多对检测疫苗株探针和流行毒株的探针，经过反复试验验证筛选，最终获得了两条可同时稳定有效检测猪流行性腹泻病毒疫苗株和流行毒株探针，并在110bp～170bp之间设计一对上下游引物，并使用一步法扩增试剂进行扩增，建立了一种可快速鉴别诊断PEDV疫苗株与流行毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，可以用于养殖场猪流行性腹泻病毒的快速检测及区分评判疫苗免疫效果。本专利技术首先提供了一对猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR引物，所述引物对分别由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条碱基序列组成，可扩增的PEDV片段长度为135bp：SEQIDNo.1：5’-AYTTTAGGCGGTTCTTTTC-3’；SEQIDNo.2：5’-ARATACCATGAACGCCACT-3’；本专利技术进一步提供了8个猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR探针，所述探针为核苷酸序列为SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的单独一种探针；或选自(1)-(4)中的任何一对探针对：(1)SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；(2)SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；(3)SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；(4)SEQIDNo.9和SEQIDNo.10。SEQIDNo.3：FAM-GCCGTCGTYGYTTTGGGTGGTT-TAMRA；SEQIDNo.4：HEX-GCAGTTGTYGYACTGGGCGGTT-TAMRA。SEQIDNo.5：CY5-TAGCTGGTACTGTGGCACAGGCAT-TAMRASEQIDNo.6：HEX-TCAACTTGGTACTGTGCTGGCCA-TAMRASEQIDNo.7：FAM-TAGCCATATTAGGAGGTGGTCAGG-BHQSEQIDNo.8：HEX-TTSTCAGCTACATCGATTCT-TAMRASEQIDNo.9：CY5-CCTAGTATGAACTCTTCTAGCT-TAMRASEQIDNo.10：FAM-ATTGGTGAAAACAGGGTGTC-TAMRA本专利技术通过大量的筛选试验发现：SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的单独一种探针或由核苷酸序列分别为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条探针组成的探针对能够稳定有效地检测猪流行性腹泻病毒疫苗株和流行毒株的荧光定量RT-PCR探针；所述的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的探针两端分别连接有FAM荧光集团和TAMAR淬灭集团；核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的探针两端分别连接有HEX荧光集团和TAMAR淬灭集团。其中，所述的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的探针的5’端连接有FAM荧光集团，其3’连接TAMAR淬灭集团；所述的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的探针的5’端连接有HEX荧光集团，其3’连接TAMAR淬灭集团。本专利技术更进一步提供了一种猪流行性腹泻病毒疫苗与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括RNA反转录试剂、荧光定量RT-PCR扩增试剂、荧光定量PCR引物对和探针。所述的RT-qPCRMIX扩增试剂包括One-StepPrimeScriptⅢRT-qPCRMix(2×)和ROXReferenceDyeⅡ(50×)。所述的荧光定量PCR引物对由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2组成；所述荧光定量PCR探针由SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的单独一种探针或由核苷酸序列分别为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条探针组成的探针对。本专利技术更进一步提供了应用所述猪流行性腹泻病毒疫苗与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR检测试剂盒的方法，包括：(1)提取待检测样品的RNA的提取；(2)将样品中提取的RNA用一步扩增法进行荧光定量RT-PCR反应；(3)根据荧光定量RT-PCR反应结果进行判定，具体判定过程为，当FAM检测探针出现S型扩增曲线且Ct值小于35，HEX探针和阴性对照均无扩增时，检测样品为PEDV流行毒株；当HEX检测探针出现S型扩增曲线且Ct值小于35，FAM探针和阴性对照均无扩增时，检测样品为PEDV疫苗毒株；当FAM探针和HEX同时扩增S型曲线时，阴性对照无扩增，检测样品为PEDV疫苗株和流行株同时感染；当FAM探针和HEX探针扩增曲线的35＜CT值≤40时，判为结果可疑，重新进行检测，重新检测结果若仍为可疑，判为阴性。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引物对和探针，其特征在于，所述引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条引物组成，所述探针为核苷酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的单独一种探针或由核苷酸序列分别为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的两条探针组成的探针对。/n
【技术特征摘要】
1.用于鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引物对和探针，其特征在于，所述引物对由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条引物组成，所述探针为核苷酸序列为SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的单独一种探针或由核苷酸序列分别为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条探针组成的探针对。
2.按照权利要求1所述的荧光定量PCR引物对和探针，其特征在于，核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的探针两端分别连接有FAM荧光集团和TAMAR淬灭集团；核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的探针两端分别连接有HEX荧光集团和TAMAR淬灭集团。
3.按照权利要求2所述的荧光定量PCR引物对和探针，其特征在于，核苷酸序列为SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱俊辉，廉维，陈立思，何玉友，杨泽彬，王国辉，李长艳，赵涵，贾小营，白杨，郑洪娟，赵丽娟，田丽华，刘振锋，
申请(专利权)人：吉林正业生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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