一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、试剂盒及方法，本发明专利技术通过在PCR反应中加入过量荧光染料，该染料与DNA双链小沟结合，且游离状态不发荧光，只有与DNA摻入后才发光，因此在PCR体系中随着PCR产物的增加荧光强度加强可快速准确检测禽腺病毒，且染料荧光定量PCR特异性高、灵敏度强、反应时间短，可进行相对定量对比不同样本病毒含量。相对定量对比不同样本病毒含量。相对定量对比不同样本病毒含量。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及荧光定量PCR检测
，特别是一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属成员，腺病毒科(Adenoviridae)可分为5个属，腺胸腺病毒属(Atadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、鱼腺病毒属(Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和唾液酸酶病毒属(Siadenovirus)。根据目前的分类，禽腺病毒属共有12个种：5个禽(禽腺病毒A
‑
E)、3个火鸡(火鸡腺病毒B
‑
D)、1个隼(隼腺病毒A)、1个鹅(鹅腺病毒A)、1个鸭(鸭腺病毒B)和1个鸽(鸽腺病毒A)腺病毒种。根据血清中和试验，禽腺病毒A
‑
E又可分为12个血清型。腺病毒大部分为长期潜伏病毒，引起无症状的感染，其中部分可以引起致病。Ⅰ群禽腺病毒存在于多种禽类的呼吸道和消化道，作为原发病原引起发病，往往与其他病毒混合感染致病。
[0003]目前，市面上禽腺病毒检测方法少没有成熟的检测试剂盒，且无法对不同样本病毒含量进行比较。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、试剂盒及方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0006]本专利技术的第一个目的是要提供一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物，所述引物如下：
[0007]上游引物F：5
’‑
TCCTTGTTACCTCCCTCTACTT
‑3’
；
[0008]下游引物R：5
’‑
GGGTTGCATTGCTGGAGATA
‑3’
。
[0009]本专利技术的第二个目的是要提供一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的试剂盒，包含上述荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、荧光染料、阴阳性对照。
[0010]本专利技术的第三个目的是要提供一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的方法，包括以下步骤：
[0011]步骤一、取待检测样品进行PCR扩增；
[0012]步骤二、在PCR反应中加入过量荧光染料，该染料与DNA双链小沟结合，且游离状态不发荧光，只有与DNA摻入后才发光，因此通过检测PCR反应液中的荧光信号强度来对目的基因进行准确定量。
[0013]进一步地，所述PCR扩增的标准程序包括：
[0014]Stage 1、预变性：95℃，30秒；
[0015]Stage 2、PCR反应：95℃、5秒，60℃、30秒，45循环；
[0016]Stage 3、溶解曲线：95℃、5秒，60℃、30秒，95℃、5秒。
[0017]进一步地，所述荧光染料为TB Green。
[0018]与现有技术相比，本专利技术通过在PCR反应中加入过量荧光染料，该染料与DNA双链小沟结合，且游离状态不发荧光，只有与DNA摻入后才发光，因此在PCR体系中随着PCR产物的增加荧光强度加强可快速准确检测禽腺病毒，且染料荧光定量PCR特异性高、灵敏度强、反应时间短，可进行相对定量对比不同样本病毒含量。
附图说明
[0019]图1为本专利技术实施例的荧光定量PCR检测禽腺病毒的试剂盒即可进行荧光定量PCR检测禽腺病毒的检测结果。
[0020]图2为PCR扩增的溶解曲线。
具体实施方式
[0021]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定专利技术。
[0022]实施例1
[0023]本实施例提供了一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物，所述引物如下：
[0024]上游引物F：5
’‑
TCCTTGTTACCTCCCTCTACTT
‑3’
；
[0025]下游引物R：5
’‑
GGGTTGCATTGCTGGAGATA
‑3’
。
[0026]实施例2
[0027]本实施例提供了一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的试剂盒，包含上述荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、荧光染料、禽腺病毒阳性对照、禽新城疫病毒、禽流感病毒、禽法氏囊病毒阴性对照。
[0028]使用本实施例的荧光定量PCR检测禽腺病毒的试剂盒即可进行荧光定量PCR检测禽腺病毒，其具体步骤如下：
[0029]步骤一、分别取禽腺病毒、禽新城疫病毒、禽流感病毒和禽法氏囊病毒细胞培物，应用TAKARA病毒DNA、RNA核酸提取试剂盒提取病毒核酸，然后分别进行PCR扩增，PCR体系为：
[0030][0031]放入荧光定量PCR器中，PCR扩增的标准程序包括：
[0032]Stage 1、预变性：95℃，30秒；
[0033]Stage 2、PCR反应：95℃、5秒，60℃、30秒，45循环；
[0034]Stage 3、溶解曲线(如图2所示)：95℃、5秒，60℃、30秒，95℃、5秒；
[0035]经过上述检测，在18个循环检测到荧光信号为禽腺病毒阳性，同时通过跑胶结果只有禽腺病毒有150bp左右条带，如图1所示，送长春库美公司测序结果为禽腺病毒。
[0036]本专利技术的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本专利技术的技术方案做出的技术变形，均落入本专利技术的保护范围之内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物，其特征在于，所述引物如下：上游引物F：5
’‑
TCCTTGTTACCTCCCTCTACTT
‑3’
；下游引物R：5
’‑
GGGTTGCATTGCTGGAGATA
‑3’
。2.一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的荧光定量PCR检测禽腺病毒的引物、荧光染料、阴阳性对照。3.一种荧光定量PCR检测禽腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、取待检测样品进行PCR扩增；步骤二、在...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬洪卫，宋松林，廉维，李晓蕊，王国辉，边少国，孟相秋，李爽，贾小营，吴晶，张馨元，周洋，江松寰，包俊威，蒋焯，陈彦男，
申请(专利权)人：吉林正业生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：