用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用技术

本发明专利技术涉及病毒检测领域，具体讲，涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用。本发明专利技术的核酸序列包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物序列。本发明专利技术试剂盒及检测方法具有特异性好、灵敏度高、步骤简单、可重复性高的技术优势。

【技术实现步骤摘要】
用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用
本专利技术涉及病毒检测领域，具体讲，涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用。
技术介绍
继全球消除脊髓灰质炎后，世界卫生组织(WHO)把消除麻疹作为下一目标。随着各国的不懈努力,近年全球麻疹发病数和发病率呈下降态势，但仍未达到消除水平。麻疹是一种由麻疹病毒引发的急性呼吸道传染病。麻疹病毒(measlesvirus，MV)属于副粘病毒科麻疹病毒属，具有高度的传染性，常伴有发热、皮疹、咳嗽、结膜炎等表现。发病率较高，感染人体后可引起麻疹及严重的并发症，包括巨细胞肺炎、包涵体脑炎等。虽然近年来随着麻疹疫苗大规模使用，麻疹发病率和死亡率大幅度降低，但麻疹在各地的局部爆发仍时有发生。早期进行诊断并采取预防措施可有效降低发病率。由于麻疹与幼儿急疹、药疹、风疹等疾病的相关症状极为相似，使鉴别难度加大。目前，临床上常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、实时荧光定量PCR等。其中ELISA是传统的应用于麻疹早期诊断的方法，患者在麻疹发作早期，体内尚未产生IgM或所产生的IgM水平较低，通常在10～15d才可上升至高峰,因此在出疹后3d内利用ELISA法检测血清标本，可能出现假阴性结果，若此时对结果作出判定，可能出现误诊现象，延误治疗。而实时荧光定量RT-PCR是较为新型的利用分子生物学进行诊断的方法。PCR技术具有检测敏感性高，操作简单、快速等优点，然而其前期投入费用较大(对实验室功能分区以及PCR仪的依赖)，而且易受实验室污染而导致假阳性。所以，亟待建立一种快速、可靠的，适合基层单位和现场应用的MV核酸检测技术。
技术实现思路
本专利技术的首要专利技术目的在于提出一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列。本专利技术的第二专利技术目的在于提出一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的试剂盒。本专利技术的第三专利技术目的在于提出一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的方法。本专利技术的第四专利技术目的在于提出该核酸序列在检测麻疹病毒中的应用。为了完成本专利技术的目的，采用的技术方案为：本专利技术涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的链置换引物序列、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针和SEQIDNo.5所示的交叉扩增引物序列。优选的，SEQIDNo.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQIDNo.4所示探针序列的5’端连接有生物素。本专利技术还涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包含恒温扩增试剂，所述恒温扩增试剂中含有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的链置换引物序列、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针和SEQIDNo.5所示的交叉扩增引物序列。优选的，SEQIDNo.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQIDNo.4所示探针序列的5’端连接有生物素。优选的，SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示链置换引物的浓度均为0.1μM、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针的浓度为0.3～0.5μM、SEQIDNo.5所示的交叉扩增引物的浓度为0.6μM。优选的，所述恒温扩增试剂中还含有1×BstBuffer、甜菜碱、MgSO4、dNTPs、RNase保护剂、BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶；优选的，所述恒温扩增试剂中含有20mMTris-HCl(pH＝8.8)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、1MMgSO4、10×Thermopolbuffer、5M甜菜碱、8U/μlBstDNA聚合酶、10UAMV逆转录酶、10mMdNTPs、25×RNAsecure。优选的，所述试剂盒中还含有RNA提取试剂。优选的，所述试剂盒中还含有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为麻疹病毒N基因片段的体外转录产物；所述阴性对照为灭菌去离子水。优选的，所述试剂盒还包括检测试纸条；优选的，所述检测试纸条选自垂直流动核酸试纸条防污染检测装置，所述垂直流动核酸试纸条防污染检测装置包括一衬垫，所述衬垫由下向上依次设置有样品垫、有色颗粒结合物垫、纤维膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠；所述纤维膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有抗荧光素抗体，所述质控线上包被有生物素，所述有色颗粒结合物垫上的有色颗粒包被有亲和素。本专利技术还涉及一种恒温扩增检测麻疹病毒的方法，至少包括以下步骤：(1)提取待检标本中提取病毒RNA；(2)将步骤(1)提取得到的病毒RNA作为模板加入到装有恒温扩增试剂的PCR管中；所述恒温扩增试剂中含有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的链置换引物序列、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针和SEQIDNo.5所示的交叉扩增引物序列；优选的，58～62℃扩增反应80～100min，78～82℃酶灭活2～3min；更优选的，恒温扩增条件为：60℃扩增反应90min，80℃酶灭活2min。(3)采用检测试纸条进行检测，优选采用垂直流动核酸试纸条防污染检测装置进行检测。本专利技术还涉及上述核酸序列在麻疹病毒检测中的应用。本专利技术的技术方案至少具有以下有益的效果：本专利技术的用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列的特异性好，由于本专利技术的核酸序列在检测过程中加入了两根特异性探针，从而确保了结果的准确性。本专利技术检测方法的灵敏度高。与琼脂糖凝胶电泳比较，检测灵敏度提高近100～200倍。本专利技术检测方法的步骤简单，可重复性高：只需要按照试剂盒的说明书经过简单的操作处理即可，且整个反应过程不需要复杂的仪器。本专利技术检测方法还具有快速、全封闭检测的技术优势。单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时。整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会。本专利技术检测方法的适用性好，可同时满足高通量和低通量的样品检测。附图说明：图1为垂直流动核酸试纸条防污染检测装置的结构示意图；图2为垂直流动核酸试纸条防污染检测装置的阳性结果的原理示意图；图3为实施例3的对比结果图；图4为实施例4的对比结果图；图5为实施例5的对比结果图；图6为实施例6的检测结果图；图7为实施例7的检测结果图。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。具体实施方式本专利技术针对现有技术存在的缺陷，提供一种适合基层单位和现场应用的，能够快速、灵敏、准确地检测麻疹病毒核酸的恒温扩增检测核酸序列、试剂盒及方法。本专利技术实施例涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列，包含SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的链置换引物序列、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针和SEQIDNo.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的链置换引物序列、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针和SEQIDNo.5所示的交叉扩增引物序列。


2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，SEQIDNo.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQIDNo.4所示探针序列的5’端连接有生物素。


3.一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含恒温扩增试剂，所述恒温扩增试剂中含有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的链置换引物序列、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针和SEQIDNo.5所示的交叉扩增引物序列。
优选的，SEQIDNo.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQIDNo.4所示探针序列的5’端连接有生物素。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示链置换引物的浓度均为0.1μM、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探针的浓度为0.3～0.5μM、SEQIDNo.5所示的交叉扩增引物的浓度为0.6μM。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增试剂中还含有1×BstBuffer、甜菜碱、MgSO4、dNTPs、RNase保护剂、BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶；
优选的，所述恒温扩增试剂中含有20mMTris-HCl(pH＝8.8)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、1MMgSO4、10×Thermopolbuffer、5M甜菜碱、8U/μlBstDNA聚合酶、10UAMV逆转录酶、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏秀兰，温永俊，韩汶延，段蓉，郑利英，
申请(专利权)人：苏秀兰，内蒙古华星康为生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15