一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法技术

本公开公开了一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法，属于生物技术领域。所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对，所述第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述第一反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本公开提供的引物组能够检测禽白血病病毒以及由禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原，有利于提高对禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原的诊断结果的准确性及防控方案的有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法
本公开涉及生物
，特别涉及一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法。
技术介绍
禽白血病是由禽白血病病毒(AvianLeukosisViruses，ALV)引起家禽的一种垂直传播性疾病，可导致禽的生产性能下降、免疫受到抑制和多器官组织肿瘤等，对养禽业危害巨大。禽白血病潜伏期长，无特异症状，亚临床感染不易发现，因此在诊断中常常被忽视。目前我国鸡群中普遍存在禽白血病病毒感染的情况。禽白血病病毒感染鸡群后，会造成鸡群的免疫受到抑制，从而导致鸡群的抵抗力下降，进而使鸡群对新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以及H5亚型和H9亚型禽流感病毒(H5/H9AIV)的易感性增强，最终引起混合感染，且具有较高的发病率和死亡率。在临床诊断中，常规的检测方法主要针对H5/H9AIV、NDV或IBV4病原，而忽略了以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9AIV、NDV或IBV4病原的情况，从而影响了诊断结果的准确性及防控方案的有效性。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本公开实施例提供了一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法。所述技术方案如下：一方面，本公开提供了一种检测病毒混合感染的引物组，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对，所述第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:1所示，所述第一反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:2所示，所述第二引物对包括：第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:3所示，所述第二反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:4所示，所述第三引物对包括：第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:5所示，所述第三反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:6所示，所述第四引物对包括：第四正向引物和第四反向引物，所述第四正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:7所示，所述第四反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:8所示，所述第五引物对包括：第五正向引物和第五反向引物，所述第五正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:9所示，所述第五反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:10所示；所述第六引物对包括：第六正向引物和第六反向引物，所述第六正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:11所示，所述第六反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:12所示；所述通用引物对包括：通用正向引物和通用反向引物。具体地，所述通用正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:13所示，所述通用反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:14所示。另一方面，本公开提供了一种测病毒混合感染的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。具体地，所述第一正向引物、所述第一反向引物的终浓度、所述第五正向引物和所述第五反向引物均为1μM/L；所述第二正向引物和所述第二反向引物、所述第三正向引物和所述第三反向引物的终浓度均为1.25μM/L，所述第四正向引物和所述第四反向引物的终浓度均为0.75μM/L；所述第六正向引物和所述第六反向引物的终浓度均为1.5μM/L；；所述正向通用引物和所述反向通用引物的终浓度均为20μM/L。具体地，所述试剂盒还包括：阳性对照样品、阴性对照样品、EXTaq聚合酶和RNaseFreedH2O。进一步地，所述EXTaq聚合酶的终浓度为5U/μL。进一步地，所述阳性对照样品包括：模板为含有H5亚型禽流感病毒HA基因的阳性标准质粒、含有H9亚型禽流感HA基因的阳性标准质粒、含有新城疫病毒F基因的阳性标准质粒、含有鸡传染性支气管炎病毒N基因的阳性标准质粒、含有B亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒和含有J亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒。进一步地，所述阴性对照样品为pMD18-T空载质粒。再一方面，本公开实施例提供了一种采用上述的引物组检测病毒混合感染的方法，其特征在于，所述方法包括：提取待测样本的RNA，将所述RNA反转录成cDNA，将所述cDNA作为模板；将所述模板与所述引物组进行扩增反应，得到扩增产物；将所述扩增产物采用毛细管电泳分析病毒。具体地，所述扩增反应包括第一阶段和第二阶段，所述第一阶段的扩增程序为每个循环均包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共10个循环；所述第二阶段的扩增程序为每个循环均包括：94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共20个循环；终延伸：72℃延伸10min。本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本公开提供的引物组能够检测禽白血病病毒以及由禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9AIV、NDV或IBV4病原，有利于对禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9AIV、NDV或IBV4病原的诊断结果的准确性及防控方案的有效性。该试剂盒能够全面检测禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9AIV、NDV或IBV4病原，从而得到准确的检测结果。该检测方法运用多重PCR扩增与毛细管电泳相结合，利用双引物的特性，采用两步法扩增，有效避免了常规多重PCR扩增中的偏好性问题，提高了扩增效率；与毛细管电泳相结合，不仅比普通凝胶电泳更环保、安全，避免有毒有害核酸染料的使用，而且提高了分辨率，在目的片段相差7bp以上即可分辨，提高了检测的准确性。附图说明为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本公开实施例三提供的毛细管电泳分析图；图2是本公开实施例三提供的模拟ND与AIV-H5混合感染的毛细管电泳分析图；图3是本公开实施例三提供的模拟AIV-H9、ND和IB混合感染的毛细管电泳分析图。具体实施方式为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。本公开的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规实验方法。本公开的实施例中所使用的试剂和仪器等如无特殊说明均可从一般商业途径获得。实施例一本公开实施例提供了一种检测病毒混合感染的引物组，该引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对，第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物，第一正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:1所示，第一反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:2所示，第二引物对包括：第二正向引物和第二反向引物，第二正向引物的序列如序列表中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测病毒混合感染的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对，/n所述第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述第一反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，/n所述第二引物对包括：第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述第二反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，/n所述第三引物对包括：第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述第三反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，/n所述第四引物对包括：第四正向引物和第四反向引物，所述第四正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述第四反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，/n所述第五引物对包括：第五正向引物和第五反向引物，所述第五正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，所述第五反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；/n所述第六引物对包括：第六正向引物和第六反向引物，所述第六正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，所述第六反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；/n所述通用引物对包括：通用正向引物和通用反向引物。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测病毒混合感染的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对，
所述第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:1所示，所述第一反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:2所示，
所述第二引物对包括：第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:3所示，所述第二反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:4所示，
所述第三引物对包括：第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:5所示，所述第三反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:6所示，
所述第四引物对包括：第四正向引物和第四反向引物，所述第四正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:7所示，所述第四反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:8所示，
所述第五引物对包括：第五正向引物和第五反向引物，所述第五正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:9所示，所述第五反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:10所示；
所述第六引物对包括：第六正向引物和第六反向引物，所述第六正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:11所示，所述第六反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:12所示；
所述通用引物对包括：通用正向引物和通用反向引物。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述通用正向引物的序列如序列表中SEQIDNO:13所示，所述通用反向引物的序列如序列表中SEQIDNO:14所示。


3.一种检测病毒混合感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的引物组。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一正向引物、所述第一反向引物的终浓度、所述第五正向引物和所述第五反向引物均为1μM/L；所述第二正向引物和所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：周祖涛，杨荣坤，肖运才，胡思顺，李自力，刘梅，许青荣，崔卫涛，毕丁仁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42