一种新型β冠状病毒(SARS‑CoV‑2)变异检测试剂盒，其特征在于，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC的漂洗液，0.1倍浓度的SSC的漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；所述的RNA探针组包括311条RNA探针，所述的RNA探针序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.311。本发明专利技术提供的一种用于新型β冠状病毒(SARS‑CoV‑2)变异检测试剂盒，可以对文库中的β冠状病毒核酸序列进行富集，提高检测灵敏性，同时检测所有人和动物的β冠状病毒，用于β冠状病毒的检测和遗传变异检测。
【技术实现步骤摘要】
一种新型β冠状病毒变异检测方法、探针和试剂盒
本专利技术涉及生物基因检测领域，尤其涉及一种基于液相探针杂交捕获的新型β冠状病毒(SARS-CoV-2)变异检测方法、探针和试剂盒。
技术介绍
SARS-CoV-2与SARS冠状病毒和“中东呼吸综合征”MERS冠状病毒，同属于β属冠状病毒，基因组为线性正链RNA。作为RNA病毒，新型冠状病毒具有很高的变异频率，其在野生动物-中间宿主-人类之间传播的过程中会发生较多变异。基于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，只针对新型冠状病毒最初发布的特异保守序列区域或某一病株抗原进行定性检测。该方法对基因变异容忍性低。如果病毒基因变异发生在引物和探针特异结合区域，会造成漏检形成假阴性诊断；同时这种方法仅限定于判断所检特定病毒的有无，无法判断病毒在各物种或人际传播过程中所发生的适应性突变而产生的新种病毒。另外，国家药监局快速批复了一款基于宏基因组建库结合二代测序技术(mNGS)的体外诊断产品。然而该方法所需的测序数据量巨大，测序成本高昂；并且该方法针对隐匿期病人样本或病毒丰度较低的样本，所需数据量并无上限，所得测序结果较难拼接成得到全长序列，较难用于病毒基因序列变异的检测。因此，本领域需要一种通用冠状病毒属基因组检测方法，以较低成本对SARS-CoV-2进行全面精准检测，并对动物宿主和病毒携带者进行监控和检测。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于液相探针杂交捕获技术开发的新型β冠状病毒变异检测方法、探针和试剂盒，可以以较低成本对SARS-CoV-2进行全面精准检测，以便于对动物宿主和病毒携带者进行监控和检测，监控病毒的变异和传播路径。在第一方面，本专利技术提供了一种新型β冠状病毒(SARS-CoV-2)变异检测序列组合，所述序列组合包括RNA探针组或其对应的DNA探针组，所述的RNA探针组包括311条RNA探针，所述的RNA探针序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.311所示。在一个实施方案中，所述序列组合还包括接头序列、第一引物组和第二引物组。所述接头序列包括SEQIDNO.334和SEQIDNO.335。所述第一引物组选自序列为SEQIDNO.314～SEQIDNO.333的引物对，用于文库扩增。其中，SEQIDNO.314和324、SEQIDNO.315和325、SEQIDNO.316和326、SEQIDNO.317和327、SEQIDNO.318和328、SEQIDNO.319和329、SEQIDNO.320和330、SEQIDNO.321和331、SEQIDNO.322和332、SEQIDNO.323和333配对使用。所述第二引物组包括正向引物和反向引物，用于杂交捕获文库序列的扩增。优选地，所述正向引物序列为SEQIDNO.312，所述反向引物序列为SEQIDNO.313。在第二方面，本专利技术提供了一种新型β冠状病毒(SARS-CoV-2)变异检测试剂盒，所述试剂盒包括RNA探针组或其对应的DNA探针组，所述的RNA探针组包括311条RNA探针，所述的RNA探针序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.311所示。在一个实施方案中，所述的试剂盒还包括：第一引物对、封闭缓冲液、RNA酶封闭液、杂交缓冲液、结合缓冲液、1倍浓度的SSC漂洗液、0.1倍浓度的SSC漂洗液、PCR反应液和TE缓冲液。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括接头序列、第一引物组和第二引物组。所述接头序列包括SEQIDNO.334和SEQIDNO.335，用于连接文库序列两端。所述第一引物组选自序列为SEQIDNO.314～SEQIDNO.333的引物对，用于文库扩增。其中，SEQIDNO.314和324、SEQIDNO.315和325、SEQIDNO.316和326、SEQIDNO.317和327、SEQIDNO.318和328、SEQIDNO.319和329、SEQIDNO.320和330、SEQIDNO.321和331、SEQIDNO.322和332、SEQIDNO.323和333配对使用。所述第二引物组包括正向引物和反向引物，用于杂交捕获文库序列的扩增。优选地，所述正向引物序列为SEQIDNO.312，所述反向引物序列为SEQIDNO.313。在一个实施方案中，所述的RNA探针为生物素标记的RNA探针。在一个实施方案中，所述的封闭缓冲液包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA和通用型封闭序列。在一个实施方案中，所述的杂交缓冲液包括SSPE溶液、Denhardt溶液、EDTA、SDS和甲酰胺。在一个实施方案中，所述的结合缓冲液包括NaCl、Tris-HCl和EDTA。在一个实施方案中，所述RNA酶封闭液为RNA酶抑制剂。在一个实施方案中，所述1倍浓度的SSC漂洗液包括1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS；所述0.1倍浓度的SSC漂洗液包括0.1倍浓度的SSC溶液、0.1％SDS和甲酰胺。在一个实施方案中，所述PCR反应液包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、和PCR反应缓冲液。在一个实施方案中，所述TE缓冲液包括10mMTris-HCl(pH8.0)和1mMEDTA(pH8.0)。在第三方面，本专利技术提供了一种新型β冠状病毒(SARS-CoV-2)变异检测方法，所述方法包括：(1)提取病毒样本的RNA；(2)构建总RNA文库，总RNA文库包括由RNA逆转录而成的cDNA双链序列和接头；(3)对所述RNA文库用RNA探针组进行两轮捕获和捕获后扩增，所述的RNA探针组包括311条RNA探针或其对应的DNA探针，所述的RNA探针序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.311所示；(4)对所述两轮捕获后扩增的扩增物进行测序。在一个实施方案中，所述方法还包括：对所述测序结果进行分析。在一个实施方案中，所述分析包括：(1)将测序数据定位到SARS-CoV-2的基因组数据MN908947.3的相应位置上，同时进行各项指标统计，包括比对率、覆盖率、重复率、捕获率、平均深度、均一性指标；(2)将测序数据比对人类参考基因组，同时分离出比对不上人类参考基因组的结果；(3)将上一步分离出的结果比对病毒库，选取比对到病毒库的结果，利用Trinity软件进行组装，得到病毒的组装结果；(4)将组装结果比对病毒库，确定病毒的分型结果是否为MN908947.3；(5)选取(4)比对到MN908947.3基因组上的结果，进行突变寻找，突变包括SNP和InDel两种类型，确定突变位点发生的基因、位置、功能、氨基酸改变等。在第四方面，本专利技术提供了RNA探针组用于制备检测新型β冠状病毒(SARS-CoV-2)变异的制剂的用途，所述的RNA探针组包括311条RNA探针或其对应的DNA探针，所述的RNA探针序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.311所示；所述检测新型β冠状病毒(SAR本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型β冠状病毒变异检测序列组合，所述序列组合包括RNA探针组，其特征在于，所述的RNA探针组包括311条RNA探针或对应的311条DNA探针，所述的RNA探针序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.311所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种新型β冠状病毒变异检测序列组合，所述序列组合包括RNA探针组，其特征在于，所述的RNA探针组包括311条RNA探针或对应的311条DNA探针，所述的RNA探针序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.311所示。
2.根据权利要求1所述的新型β冠状病毒变异检测序列组合，其特征在于，所述序列组合还包括接头序列、第一引物组和第二引物组；所述接头序列包括SEQIDNO.334和SEQIDNO.335；所述第一引物组选自序列为SEQIDNO.314～SEQIDNO.333的引物对，用于文库扩增。其中，SEQIDNO.314和324、SEQIDNO.315和325、SEQIDNO.316和326、SEQIDNO.317和327、SEQIDNO.318和328、SEQIDNO.319和329、SEQIDNO.320和330、SEQIDNO.321和331、SEQIDNO.322和332、SEQIDNO.323和333配对使用；所述第二引物组包括正向引物和反向引物，用于杂交捕获文库序列的扩增。优选地，所述正向引物序列为SEQIDNO.312，所述反向引物序列为SEQIDNO.313。
3.根据权利要求1或2所述的新型β冠状病毒变异检测序列组合，其特征在于，所述的RNA探针为生物素标记的RNA探针。
4.一种新型β冠状病毒变异检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1-3任一项所述的新型β冠状病毒变异检测序列组合。
5.根据权利要求4所述的新型β冠状病毒变异检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：封闭缓冲液、RNA酶封闭液、杂交缓冲液、结合缓冲液、1倍浓度的SSC漂洗液、0.1倍浓度的SSC漂洗液、PCR反应液和TE缓冲液。
6.根据权利要求5所述的新型β冠状病毒变异检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭缓冲液包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：杭兴宜，孙永乐，梁加龙，屈武斌，王瑞超，蔡万世，
申请(专利权)人：广西识远医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45
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