SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测及专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开了一种SADS‑CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测及引物和探针，并基于该引物和探针提供用于同时鉴别检测SADS‑CoV和PDCoV的试剂盒，属于生物检测技术领域。利用该试剂盒的检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可以用于对SADS‑CoV和PDCoV进行定性鉴别检测，还可以实现准确定量，能在疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中应用。

【技术实现步骤摘要】
SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测及专用引物和探针
本专利技术属于生物检测
中的兽医动物病原检测，具体涉及一种用于SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。
技术介绍
冠状病毒对人和家畜的危害严重。2019年3月马静云等在国外杂志《Nature》报道了在华南某猪场发生急性腹泻疾病暴发的病例中分离鉴定出1个新的冠状病毒，即猪急性腹泻综合征冠状病毒(swineacutediarrheasyndromecoronavirus，SADS-CoV)。该病毒引起的的临床症状与其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状非常相似，可严重感染各种年龄的猪且造成急性呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡，而感染的母猪只有轻度腹泻，大多数母猪在两天内恢复。随着规模化、集约化养猪业的持续发展，猪SADS-CoV已经或可能给养殖业带来潜在的重大经济损失。猪丁型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，PDCoV)又称为猪德尔塔冠状病毒，为单股正链RNA病毒，与猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因组结构相似。2012年中国香港对该病毒进行了首次报道，2014年2月，美国学者在腹泻仔猪和母猪的粪便中检测到PDCoV，加拿大、韩国、泰国和我国大陆也先后从腹泻猪的样本中检测到PDCoV。感染猪的临床症状类似于SADS-CoV感染，表现为仔猪、母猪水样腹泻和仔猪死亡。随着PDCoV在全球范围内的不断流行和演化，以及新发病原SADS-CoV的出现，它们相似的临床症状给猪腹泻病的鉴别诊断和防控带来了新的挑战。文献CN108315490A公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法，其采用套式PCR扩增，分为反转录步骤、第一次PCR扩增和第二次PCR扩增，并且针对每种病毒分别使用了不同的两对PCR扩增引物，因此其反应体系较为复杂，操作繁琐；并且其提供的试剂盒的检测极限仅为5.02×10-4ng·μL-1，相当于105copies/μL，因此检测灵敏度也较低，不能够满足对猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒进行快速和高灵敏度鉴别检测的需要。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术一个方面提供一种用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组，包含：用于检测SADS-CoV的上游引物(SADS-CoV-F)和下游引物(SADS-CoV-R)，其中所述上游引物(SADS-CoV-F)的核苷酸序列如SEDIDNO：3所示，所述下游引物(SADS-CoV-R)的核苷酸序列如SEDIDNO：4所示；用于对SADS-CoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(SADS-CoV-P)，所述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的核苷酸序列如SEDIDNO：5所示；用于检测PDCoV的上游引物(PDCoV-F)和下游引物(PDCoV-R)，其中所述上游引物(PDCoV-F)的核苷酸序列如SEDIDNO：6所示，所述下游引物(PDCoV-R)的核苷酸序列如SEDIDNO：7所示；用于对PDCoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(PDCoV-P)，所述TaqMan探针(PDCoV-P)的核苷酸序列如SEDIDNO：8所示；所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。上述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有TAMRA荧光淬灭基团；所述TaqMan探针(PDCoV-P)的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基团。本专利技术另一方面提供一种用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的试剂盒，包括上述的引物和TaqMan探针组；使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SVV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R(10μM)0.75μL，PDCoV-P(10μM)0.5μL。上述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为SADS-CoV和PDCoV基因组RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，所述阴性对照品为不含SADS-CoV和PDCoV的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。上述试剂盒中还包括标准品：SADS-CoV标准品和PDCoV标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。上述的引物和TaqMan探针组或上述的试剂盒在对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的检测中的应用也属于本专利技术的内容。上述的检测应用为用实时荧光定量PCR技术对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：1)建立标准曲线：将SADS-CoV标准品和PDCoV标准品等浓度混合，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在上述的引物和TaqMan探针组的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制各自标准曲线；2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在上述的引物和TaqMan探针组的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；3)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对SADS-CoV和PDCoV的定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含SADS-CoV和PDCoV的拷贝数，实现定量检测。上述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(购于TakaRa公司)，SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SADS-CoV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R(10μM)0.75本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组，其特征在于，包含：/n用于检测SADS-CoV的上游引物(SADS-CoV-F)和下游引物(SADS-CoV-R)，其中所述上游引物(SADS-CoV-F)的核苷酸序列如SED ID NO：3所示，所述下游引物(SADS-CoV-R)的核苷酸序列如SED ID NO：4所示；/n用于对SADS-CoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(SADS-CoV-P)，所述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的核苷酸序列如SED ID NO：5所示；/n用于检测PDCoV的上游引物(PDCoV-F)和下游引物(PDCoV-R)，其中所述上游引物(PDCoV-F)的核苷酸序列如SED ID NO：6所示，所述下游引物(PDCoV-R)的核苷酸序列如SEDID NO：7所示；/n用于对PDCoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(PDCoV-P)，所述TaqMan探针(PDCoV-P)的核苷酸序列如SED ID NO：8所示；/n所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。/n...

【技术特征摘要】
1.用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组，其特征在于，包含：
用于检测SADS-CoV的上游引物(SADS-CoV-F)和下游引物(SADS-CoV-R)，其中所述上游引物(SADS-CoV-F)的核苷酸序列如SEDIDNO：3所示，所述下游引物(SADS-CoV-R)的核苷酸序列如SEDIDNO：4所示；
用于对SADS-CoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(SADS-CoV-P)，所述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的核苷酸序列如SEDIDNO：5所示；
用于检测PDCoV的上游引物(PDCoV-F)和下游引物(PDCoV-R)，其中所述上游引物(PDCoV-F)的核苷酸序列如SEDIDNO：6所示，所述下游引物(PDCoV-R)的核苷酸序列如SEDIDNO：7所示；
用于对PDCoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(PDCoV-P)，所述TaqMan探针(PDCoV-P)的核苷酸序列如SEDIDNO：8所示；
所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。


2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针组，其特征在于，所述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有TAMRA荧光淬灭基团；
所述TaqMan探针(PDCoV-P)的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基团。


3.用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的试剂盒，其特征在于：
包括权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针组；
使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SVV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R(10μM)0.75μL，PDCoV-P(10μM)0.5μL。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为SADS-CoV和PDCoV基因组RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，所述阴性对照品为不含SADS-CoV和PDCoV的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。


5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括标准品：SADS-CoV标准品和PDCoV标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。


6.权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针组或权利要求3、4或5所述的试剂盒在对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的检测中的应用。


7.根据权利要求6所述的检测应用，其特征在于：
为用实时荧光定量PCR技术对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽媛，陈君彦，王艳杰，王秀明，刘建奇，刘东霞，刘亭岐，李静，郝鹏，黄海碧，关平原，张贵刚，范秀丽，刘国英，魏学峰，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15