用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于微生物的鉴别，特别是指一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用。以鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.1650或CGMCC No.19480的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以序列分别为SEQ No.5、SEQ No.6的引物1及引物2作为引物进行PCR扩增后获得，本发明专利技术克服了使用三赞胶、结冷胶和温轮胶的复配胶体系中必需通过克隆测序等其他操作才能将三种胶体彼此分开，步骤比较繁琐等问题。具有可以从包含三赞胶的中轻度加工产品中鉴别出三赞胶，具有检测时间短、准确性高的优点。

【技术实现步骤摘要】
用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用
本专利技术属于微生物的鉴别，特别是指一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用。
技术介绍
食品胶由多糖及其复合物组成，充分水化后能形成粘稠或凝胶状的高分子水溶胶，在食品加工中起到增稠、胶凝、悬浊等作用，使食品获得所需要的各种形状和软、硬、脆、黏等口感。食品胶按来源可分为植物胶、动物胶、微生物胶和化学改性胶，其中微生物胶性能优越、生产周期短、不受气候、地理环境的影响，已经在食品领域大规模应用，例如野油菜黄单胞菌合成的黄原胶和少动鞘氨醇单胞菌合成的结冷胶等。近年来研究者发现，除结冷胶外，鞘氨醇单胞菌属的菌株还能合成多种微生物胶，例如温轮胶、三赞胶等，这些微生物胶的多糖主链都由葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖和(或)甘露糖组成，但侧链基团种类、位置多样，具有各自独特的理化性质和用途，被统称为鞘氨醇胶。三赞胶又称鞘氨醇胶Ss，是由三赞鞘氨醇单胞菌合成的一种新型微生物胶，具有优良的增稠、胶凝、乳化和悬浮稳定性能，是鞘氨醇胶类聚合物的一个新品种，也是第一个完全由国内自主研发并实现工业化生产的微生物源食品胶。根据《食品添加剂新品种申报与受理规定》和《食品添加剂新品种管理办法》的规定，2018年12月三赞胶已通过国家卫健委专家评审委员会技术审查，主要作为增稠剂、稳定剂和凝固剂，用于果蔬汁(浆)类饮料、植物蛋白饮料和肉灌肠等产品中。食品胶在生物工业应用时，经常根据食品胶单体的性质和功能，将两种或两种以上功能互补或有协同作用的单体按照一定比例进行复配，从而产生无数种复配胶，以满足食品生产的不同需要。微生物胶中的三赞胶、结冷胶和温轮胶等品种都是鞘氨醇单胞菌属菌株合成，目前还没有一种快速鉴别方法，特别是国内自主研发的三赞胶，从生产菌株保护和应用市场规范的角度出发都需要一种鉴别三赞胶合成菌和从复配胶产品中鉴别三赞胶的方法。随着三赞胶的应用和推广，规范这类产品的应用市场，鉴别一种产品中是否添加了三赞胶，特别是使用复配胶后，如何快速鉴别三赞胶成为亟需解决的问题。凭借多糖的结构鉴别三赞胶非常复杂，需要纯化多糖，然后使用Sminth水解、甲基化分析和二维核磁共振谱等复杂的步骤和分析方法。申请号为201811206214.9的专利文献共公开了“一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用”，该专利文献中公开的技术可用于三赞胶的鉴别，但在同时使用三赞胶、结冷胶和温轮胶的复配胶体系中，由于这三种微生物胶是鞘氨醇单胞菌属不同菌株合成的，彼此之间的同源性较高，鉴别引物会扩增得到大小接近的三种PCR产物，必需通过克隆测序等其他操作才能将三种胶体彼此分开，步骤比较繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记。本专利技术的目的之二在于提供一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对。本专利技术的目的之三在于提供一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记的制备方法。本专利技术的目的之四在于提供用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在三赞胶及其合成菌快速鉴定及检测中的应用。本专利技术的目的之五在于提供用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在包含三赞胶的中轻度加工产品中三赞胶的鉴别方面的应用。本专利技术的整体技术构思是：一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记所述分子标记为SEQNo.13所示的核苷酸序列。一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对，所述引物对能够扩增得到SEQNo.13所示的核苷酸序列。用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为SEQNo.5所示的核苷酸序列，或为SEQNo.5所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列；所述引物2为SEQNo.6所示的核苷酸序列，或为SEQNo.6所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列。用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记的制备方法，包括上述所述的引物对、DNA聚合酶和/或dNTPs，具体步骤如下:A、以保藏编号为CGMCCNo.1650或者CGMCCNo.19480、拉丁文名称为Sphingomonassp.的鞘氨醇单胞菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以引物1及引物2作为引物进行PCR反应；B、PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA＝1.0μL；10μM的引物1＝0.5μL；10μM的引物2＝0.5μL；10mM的dNTP＝1.0μL；10×缓冲液＝2.5μL；5U/μL的PlatinumTaqDNA聚合酶＝0.5μL；加超纯水至25μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，55℃-63℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；电泳检测PCR扩增产物为950bp左右；C、PCR扩增产物DNA测序，去除影响测序准确性的两端引物序列后，得到代表三赞胶及其合成菌的核心保守序列920bp，即为用于鉴别三赞胶及其合成菌的特异性分子标记。用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在三赞胶及其合成菌快速鉴定及检测中的应用。用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在包含三赞胶的中轻度加工产品中三赞胶的鉴别方面的应用。三赞胶合成菌为鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonassp.，保藏编号为CGMCCNo.1650或者CGMCCNo.19480。本专利技术的菌种为鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonassp.，保藏编号为CGMCCNo.1650，上述菌种申请人已于2006年3月14日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏机构的地址位于北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所(该保藏机构目前已迁址至北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，简称CGMCC。本专利技术中的鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonassp.，保藏编号为CGMCCNo.19480，上述菌种申请人已于2020年3月16日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，简称CGMCC。本专利技术所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：本专利技术从三赞胶合成基因簇和比较基因组的角度，筛选出三赞胶及三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.CGMCCNo.1650或CGMCCNo.19480的特异性分子标记，可以从包含三赞胶的中轻度加工产品中鉴别出这种微生物胶，具有检测时间短、准确性高的优点。附图说明本专利技术的附图有：图1为三赞胶与温轮胶、结冷胶的多糖结构比较图，图中Glc为葡萄糖，Man为甘露糖，GlcA为葡萄糖醛酸，Rha为鼠李糖，Acetyl为乙酰基，Glyceroyl为甘油酰基。图2为本专利技术中引物1/2对微生物胶合成菌的PCR扩增产物电泳检测图谱，其中M为分子量标记，1为阴性对照；2为鞘氨醇单胞菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记，其特征在于所述分子标记为SEQNo.13所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记，其特征在于所述分子标记为SEQNo.13所示的核苷酸序列。


2.一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对，其特征在于所述引物对能够扩增得到SEQNo.13所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求2所述的用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为SEQNo.5所示的核苷酸序列，或为SEQNo.5所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列；所述引物2为SEQNo.6所示的核苷酸序列，或为SEQNo.6所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列。


4.根据权利要求1所述的用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记的制备方法，其特征在于包括权利要求2或3所述的引物对、DNA聚合酶和/或dNTPs，具体步骤如下:
A、以保藏编号为CGMCCNo.1650或者CGMCCNo.19480、拉丁文名称为Sphingomonassp.的鞘氨醇单胞菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以引物1及引物2作为引物进行PCR反应；
B、PCR扩增体系为：10-30...

【专利技术属性】
技术研发人员：张禹，张国沛，张少华，
申请(专利权)人：河北鑫合生物化工有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13