【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵，特别是指高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法。
技术介绍
1、硬葡聚糖又称为小核菌多糖，是高分子量，非离子型的支链葡聚糖；具有优良的增稠性、假塑性、耐高温、高盐及较广范围的ph适应性，可广泛用于石油、油漆、陶瓷、食品等行业。它是以β-d-(1-3)吡喃葡萄糖基为主链，每三个葡萄糖由β-d-(1-6)吡喃葡萄糖基为侧链的葡聚糖。硬葡聚糖可由小核菌属丝状真菌纯培养发酵得到。
2、目前已有微生物生产硬葡聚糖的文献报道，现有的研究多集中于发酵培养基的优化方面。然而，由于硬葡聚糖通常由真菌发酵生产，发酵产物及产品存在着粘度低、溶解性差，作为油田化学剂使用时注入性差等不足。这严重限制了其市场(特别是石油工业领域)的开发拓展。因此，研究一种工艺简单、发酵液粘度高、产品溶解性、注入性好的生产硬葡聚糖方法，对提高硬葡聚糖的工业化生产水平及产品适用性具有重要意义。
3、申请人检索的现有技术献包括：
4、申请号为201910225453.7的专利文献中采用保藏编号为cgmccno.7760，拉丁文名称为athelia rolfsii的罗氏阿太菌接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；调节培养液的ph，进行通气搅拌发酵等工艺步骤，培养液中采用玉米绵白糖及豌豆蛋白作为主要成分。采用以上方法仍然存在发酵液的粘度低(一般在2000cp～2500cp)、产品溶解性差的问题。
5、申请人未发现与本专利技术相同或相近似的文献报道。
技术实现思路>
1、本专利技术的目的在于公开了一种高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，通过采用提高接种量，控制发酵中温度、通风量、搅拌转速以及碳源含量等技术措施，使发酵结束后所得到的发酵液粘度得到有效提高，发酵液经过去除菌体并纯化制成的硬葡聚糖具有较好的溶解性、耐钙性和注入性。
2、本专利技术的整体技术构思是：
3、高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，是将保藏编号为cgmcc no.7760，拉丁文名称为athelia rolfsii的罗氏阿太菌接种到含有碳源、氮源及营养物质的无菌培养液中，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液；无菌培养液由如下含量的原料组成：
4、葡萄糖4％～5％；果糖4％～5％；硝酸钠0.3％～0.5％；磷酸氢二铵0.3％～0.5％；余量为无菌水；ph＝5.0～6.0；
5、通气发酵的条件是：按照接种量为20％～30％的体积比，将含有保藏编号为cgmccno.7760，拉丁文名称为athelia rolfsii的罗氏阿太菌的种子液接入无菌培养液；温度30℃～32℃；通风量1.5vvm～2vvm；搅拌转速400～500转/分；发酵20小时至50小时控制培养液中葡萄糖及果糖浓度为4％～5％；至发酵液粘度不再增长或发酵周期≤70小时发酵结束。
6、本专利技术中的菌种已于2013年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类名为罗氏阿太菌(athelia rolfsii)，保藏编号为cgmcc no.7760，保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(简称cgmcc)。
7、其中生产方法中的各工艺步骤的工艺条件如下：
8、为进一步有效提高发酵结束后所获得的发酵液粘度值，优选的技术实现手段是，所述的种子液粘度为不低于100cp。
9、发酵过程中控制碳源浓度不仅能够利于菌体有效生长，更为重要的是，申请人发现能够有效促进产物合成，出于降低工业生产经济化运行成本的考虑，优选的技术实现手段是，发酵20小时至50小时控制葡萄糖及果糖浓度采用补入葡萄糖和/或果糖。
10、为满足工业化生产并缩短生产周期的需要，优选的技术实现手段是，所述的种子液是将保藏编号为cgmccno.7760，拉丁文名称为athelia rolfsii的罗氏阿太菌经过扩大培养后制成。
11、为满足种子液的有效增长，有效提高对于发酵过程中碳源、氮源及营养成分的适应性，保证后续发酵过程的顺利进行，优选的技术实现手段是，所述的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备；其中一级种子制备是将含有保藏编号为cgmccno.7760，拉丁文名称为athelia rolfsii的罗氏阿太菌的摇瓶种子接种到一级种子培养液中培养后制成，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
12、葡萄糖1％～2％；果糖1％～2％；酵母浸粉0.4％～0.5％；硝酸钠0.2％～0.3％；余量为无菌水；ph＝5.0～6.0；
13、所述的二级种子制备是将一级种子接种到二级种子培养液中培养后制成，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
14、葡萄糖1％～2％；果糖1％～2％；硝酸钠0.5％～0.8％；磷酸氢二铵0.5％～0.8％；余量为无菌水；ph＝5.0～6.0。
15、种子液培养过程中的条件控制能够有效满足种子生长的需要并适应规模发酵的生长环境，缩短培养周期，优选的技术实现方式是，所述的一级种子、二级种子制备过程中的工艺条件是：接种量为20％～30％，培养温度30℃～32℃，通风量1.0vvm～1.5vvm，至种子液粘度不低于100cp时制成一级种子、二级种子。
16、发酵液粘度采用如下方法测定：
17、选用测定误差±5％的ndj—4型旋转粘度计，测定条件为转子型4号，步骤为取发酵液500ml置于烧杯内，用4号转子60转/分钟测定，读出表盘示数乘以系数即得粘度值。
18、对于发酵结束后发酵液中菌体的去除采用加入蛋白酶和/或溶菌酶的方式，后提取制备硬葡聚糖采用本领域常规方法，即加酸碱调ph后升温反应，对反应体系醇提萃取、固液分离后干燥得到硬葡聚糖成品。为验证利用本专利技术中发酵液所制备的硬葡聚糖的性能，以满足油田领域需要，适应矿化率高，含钙多的地层状况，避免硬葡聚糖溶液通过地层时容易发生堵塞现象。申请人根据客户需要，进行了如下试验：
19、一、溶解性
20、1、将本专利技术中获得的硬葡聚糖溶于水，在搅拌转速为500转/分钟、搅拌时间30分钟后粘度达到最大时观察溶解性；
21、2、测试结果为溶解完全，无颗粒。
22、二、耐钙性
23、1、仪器设备
24、分析天平：精确至0.001g；高速搅拌器；六速旋转粘度计；滚子加热炉。
25、2、所需试剂
26、30％cacl2溶液的制备
27、精确称取300g无水氯化钙(精确至0.001g)，用少量蒸馏水溶解，然后定容至1000ml。
28、3、分析步骤
29、用洁净、干燥的称量纸准确称取3.5g试样(精确至0.001g)。量取350ml盐水倒入搅拌杯中，将盛水溶液的搅拌杯置于搅拌器下，开启搅拌器，转速8000转/分钟，将试样慢慢加入搅拌杯中，并开始计时，连续搅拌30分钟。将上述溶液置于陈化釜内，旋紧盖子，置于设定65℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，是将保藏编号为CGMCCNo.7760，拉丁文名称为Athelia rolfsii的罗氏阿太菌接种到含有碳源、氮源及营养物质的无菌培养液中，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液；其特征在于无菌培养液由如下含量的原料组成：
2.根据权利要求1所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于所述的种子液粘度为不低于100cp。
3.根据权利要求1所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于控制葡萄糖及果糖浓度采用发酵过程中补入葡萄糖和/或果糖。
4.根据权利要求1或2所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于所述的种子液是将保藏编号为CGMCCNo.7760，拉丁文名称为Athelia rolfsii的罗氏阿太菌经过扩大培养后制成。
5.根据权利要求4所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于所述的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备；其中一级种子制备是将含有保藏编号为CGMCCNo.7760，拉丁文名称为Athelia rolfsii的罗氏阿太菌的摇瓶种子接种到一级种子培养液
6.根据权利要求5所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于所述的二级种子制备是将一级种子接种到二级种子培养液中培养后制成，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成：
7.根据权利要求5所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于所述的一级种子、二级种子制备过程中的工艺条件是：接种量为20％～30％，培养温度30℃～32℃，通风量1.0vvm～1.5vvm，至种子液粘度不低于100cp时制成一级种子、二级种子。
...【技术特征摘要】
1.高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，是将保藏编号为cgmccno.7760，拉丁文名称为athelia rolfsii的罗氏阿太菌接种到含有碳源、氮源及营养物质的无菌培养液中，进行通气搅拌发酵得到硬葡聚糖发酵液；其特征在于无菌培养液由如下含量的原料组成：
2.根据权利要求1所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于所述的种子液粘度为不低于100cp。
3.根据权利要求1所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于控制葡萄糖及果糖浓度采用发酵过程中补入葡萄糖和/或果糖。
4.根据权利要求1或2所述的高粘度硬葡聚糖发酵液的制备方法，其特征在于所述的种子液是将保藏编号为cgmccno.7760，拉丁文名称为athelia rolfsii的罗氏阿太菌经过扩大培养后制成。
5.根据权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张禹，张国沛，张少华，贾敬敏，
申请(专利权)人：河北鑫合生物化工有限公司，
类型：发明
国别省市：
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