【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑领域，具体涉及一种具有dna切割活性的cas12m蛋白及其应用。
技术介绍
1、基因编辑(gene editing)技术使得dna序列定位点进行改造成为可能，比如第一代基因编辑工具锌指核酸酶(zinc finger nucleases，zfns)，第二代基因编辑工具类似转录激活的小型核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，talens)都可以用于改造靶向基因组，但是这些方法设计困难，不易制作，成本昂贵且普适性不强。
2、crispr-cas系统最初来源于细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统，用于抵御入侵细菌和古菌的核酸成分，crispr是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，是由可以感染原核生物的噬菌体dna片段衍生来的，它可以检测并摧毁能引起相似感染的其他噬菌体中相似的dna，因此对原核生物抗噬菌体至关重要，所以该序列是许多原核生物的免疫系统。cas蛋白是指crispr-associated蛋白，它是crispr系统中的相关蛋白。crispr基因座由一个编码cas蛋白的操纵子及一个重复间隔序列(repeat spacer)构成，可以利用crispr序列中间隔序列(spacer)对应的rna指引，识别并且切割特定与其序列互补的dna链。crispr/cas9系统属于2类crispr系统，由ca
3、目前，crispr/cas系统已从最初的crispr/cas9发展到现在的crispr/cas12a、crispr/cas13a等多种基因编辑系统。其中，crispr-cas12a是2类rna引导的核酸内切酶，可用于编辑哺乳动物基因组的crispr系统。2015年9月，张锋团队(zetsche b，gootenberg js，abudayyeh o o，et al.cpf1 is a single rna-guided endonuclease of a class2crispr-cas system.cell，2015，163(3)：759-771.)为crispr家族增添一个新成员——cpf1，属于crispr-cas系统2类v型，crispr/cpf1系统属于class2 type v，其尺寸较小，同时具备rna核酸内切酶和dna核酸内切酶的能力，能够识别富含胸腺嘧啶(t)的pam序列，扩展了crispr/cas系统的可编辑范围。该系统不仅拥有较好的靶向切割dna活性，同时还展现出显著区别于crispr-cas9的编辑特点。cas12a核酸酶扩大了基因编辑靶位点的选择范围，同时脱靶效应更低。相对于cas9核酸酶，cas12a核酸酶识别与crrna间隔区互补的dna靶序列，无需使用tracrrna。并且，cas12a蛋白酶分子量更小，更易进入细胞，编辑成功率更高。cpf1蛋白的切割只需要单条rna引导，此功能可以简化基因编辑工具的设计与使用。在crispr/cas12系统中，crrna与cas12蛋白形成复合体后，cas12蛋白被激活发生结构改变，crrna会与靶dna序列形成互补结构，cas12蛋白行使切割dna的功能，使dna发生断裂损伤。
4、最近的研究已经确定了十几种功能不同的cas12效应蛋白，其中一些cas12被报道表现出rna引导的dsdna干扰活性，但缺乏靶向dsdna切割活性([1]wu，w.y.，mohanraju，p.，liao，c.，adiego-pérez，b.，creutzburg，s.c.a.，makarova，k.s.，keessen，k.，lindeboom，t.a.，khan，t.s.，prinsen，s.，joosten，r.，yan，w.x.，migur，a.，laffeber，c.，scott，d.a.，lebbink，j.h.g.，koonin，e.v.，beisel，c.l.，&van der oost，j.(2022).theminiature crispr-cas12m effector binds dna to block transcription.molecularcell，82(23)，4487-4502.e7.https：//doi.org/10.1016/j.molcel.2022.11.003.[2]omura，s.n.，nakagawa，r.，südfeld，c.，villegas warren，r.，wu，w.y.，hirano，h.，laffeber，c.，kusakizako，t.，kise，y.，lebbink，j.h.g.，itoh，y.，van der oost，j.，&nureki，o.(2023).mechanistic and evolutionary insights into a type v-m crispr-cas effector enzyme.nature structural&molecular biol ogy.https：//doi.org/10.1038/s41594-023-01042-3.)。除了cas12f，cas12m比其他cas12蛋白小得多，在基因治疗中具有更明显的优势，但缺乏dna切割活性限制了其在临床中的应用。目前，尚未有任何公开或报道过的具有dna切割活性的cas12m蛋白。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中cas12m缺乏dna切割活性的缺陷，本专利技术提供了一种新型的cas12m亚型蛋白，命名为imgvr 18，该cas12m亚型蛋白具有明显的dna切割活性，在基因编辑领域中具有潜在的应用前景。
2、一种新型的cas12m亚型蛋白，即一种具有dna切割活性的cas12m蛋白，所述cas12m蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，或所述蛋白的氨基酸序列与seq id no.1有至少90％的同源性且其中第269、271、280氨基酸相同或第345、506、594位的氨基酸相同。
3、该新型的cas12m亚型蛋白在进化分析中与cas12m同源，但与发表文献中的ca本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有DNA切割活性的Cas12m蛋白，其特征在于，所述Cas12m蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述Cas12m蛋白的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种包含权利要求2或3所述多核苷酸的载体。
5.一种CRISPR/Cas12m系统，其特征在于，包含权利要求1所述的Cas12m蛋白或编码权利要求1所述Cas12m蛋白的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的CRISPR/Cas12m系统，其特征在于，还包含CRISPR RNA。
7.如权利要求6所述的CRISPR/Cas12m系统，其特征在于，所述CRISPR RNA的序列如SEQID NO.3所示。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求5～7任一所述的CRISPR/Cas12m系统。
9.权利要求1所述的Cas12m蛋白、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的载体、或权利要求5～7任一项所述的CRI
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为靶向切割目标DNA。
...【技术特征摘要】
1.一种具有dna切割活性的cas12m蛋白，其特征在于，所述cas12m蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种编码权利要求1所述cas12m蛋白的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如seq id no.2所示。
4.一种包含权利要求2或3所述多核苷酸的载体。
5.一种crispr/cas12m系统，其特征在于，包含权利要求1所述的cas12m蛋白或编码权利要求1所述cas12m蛋白的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的crispr/cas1...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜先月，李文慧，王无可，蔡润泽，唐进，
申请(专利权)人：之江实验室，
类型：发明
国别省市：
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