利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂技术

本发明专利技术公开了利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂。本发明专利技术所提供的成套试剂由引物对Cmm和探针P组成；引物对Cmm由引物F和引物R组成；引物F、引物R和探针P的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:3所示。实验证明，采用本发明专利技术所提供的方法数字PCR检测番茄溃疡病菌，特异性好、灵敏度高且重复性好，还能够有效解决检测番茄溃疡病菌中出现的假阴性的结果。本发明专利技术为检测重要检疫性病害提供了一种新的可靠的检测手段，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂
本专利技术属于生物
，具体涉及利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂。
技术介绍
番茄溃疡病菌即密执安棒形杆菌密执安亚种(C.michiganensissubsp.michiganensis，Cmm)，能够引起番茄溃疡病，寄主植株的不同龄期、品种的易感性、番茄溃疡病菌的毒力性以及外界环境的温度和湿度都会使感病植株产生不同的症状。目前，番茄溃疡病菌已经成为世界性病害，并被我国在内的20多个国家列为重要的检疫性病害。番茄溃疡病菌是使典型的种传病害，一般感染番茄溃疡病菌的植株会产生感染病菌的种子或果实，使用无带菌的种子进行种植或者无病菌的植株进行移植已经成为预防番茄溃疡病菌传播的重要方法。番茄溃疡病菌的检测方法包括症状观察法、菌落形态观察法、植株检测法、种子检测法和致病性检测法在内的传统检测方法，以及血清学检测方法和分子生物学PCR检测方法。PCR检测方法是目前最常用的技术，但是对于低带菌量的种子样品的检测结果并不理想，会导致假阴性。此外，随着新亚种的发现，现有检测方法的特异性需要进一步确认，以确定是否可以将Cmm与其他亚种，尤其是密切相关的非致病性亚种准确区分。数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的定量分子检测技术，与实时荧光定量PCR相比，数字PCR的结果值不再依赖于CT值。数字PCR已成功应用于基因谱分析、产前诊断以及与癌症相关的等位基因和突变检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是检测番茄溃疡病菌。本专利技术首先保护检测番茄溃疡病菌的成套试剂，可由引物对Cmm和探针P组成；所述引物对Cmm可由引物F和引物R组成；所述引物F可为如下a1)或a2)：a1)SEQIDNO:1所示的单链DNA分子；a2)将SEQIDNO:1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO:1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物R可为如下b1)或b2)：b1)SEQIDNO:2所示的单链DNA分子；b2)将SEQIDNO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO:2具有相同功能的单链DNA分子；所述探针P可为如下c1)或c2)：c1)SEQIDNO:3所示的单链DNA分子；c2)将SEQIDNO:3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。所述a2)、所述b2)或所述c2)中，所述“经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加”可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述成套试剂中，所述探针P的末端可具有荧光标记。上述成套试剂中，所述探针P的5′末端可具有FAM荧光标记，3′末端可具有TAMRA荧光标记。上述成套试剂中，所述引物F、所述引物R和所述探针P的摩尔比具体可为1：1：1。上述成套试剂中的所述引物对Cmm也属于本专利技术的保护范围。上述引物对Cmm中，所述引物F和所述引物R的摩尔比具体可为1：1。本专利技术还保护上述任一所述成套试剂的应用，可为如下d1)或d2)或d3)：d1)制备用于检测或辅助检测番茄溃疡病菌的试剂盒；d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。本专利技术还保护上述任一所述引物对Cmm的应用，为如下d1)或d2)或d3)：d1)制备用于检测或辅助检测番茄溃疡病菌的试剂盒；d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。本专利技术还保护含有上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对Cmm的试剂盒。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，将所述引物F、所述引物R和/或所述探针P分别单独包装。本专利技术还保护所述试剂盒的应用，为d2)或d3)：d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。本专利技术还保护检测待测样品是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌的方法。本专利技术所保护的检测待测样品是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法A1)，包括如下步骤：以待测样品的总DNA为模板，以上述任一所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述总DNA的数字PCR，则待测样品中含有或疑似含有番茄溃疡病菌；如果所述成套试剂不能实现对所述总DNA的数字PCR，则待测样品不含有或疑似不含有番茄溃疡病菌。本专利技术所保护的检测待测样品是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法A2)，包括如下步骤：以待测样品的总DNA为模板，以上述任一所述引物对Cmm进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对Cmm可以实现对所述总DNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有番茄溃疡病菌；如果所述引物对Cmm不能实现对所述总DNA的PCR扩增，则待测样品不含有或疑似不含有番茄溃疡病菌。上述任一所述的方法中，所述待测样品可为种子或植株。所述植株具体可为番茄植株或番茄叶片。所述种子可为番茄种子。当待测样品为植株时，待测样品的总DNA具体可为待测植株的基因组DNA。当待测样品为种子，待测样品的总DNA具体可为待测种子的总DNA。待测种子的总DNA的获得方法如下：先处理种子，收集沉淀；再从沉淀中提取DNA，即得到待测种子的总DNA。处理种子的方法为：将种子样品倒入灭菌三角瓶中，加入适量无菌水，使种子完全覆盖，4℃浸泡过夜；取10mL浸出液，离心，收集沉淀。本专利技术还保护鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌的方法。本专利技术所保护的鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法B1)，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA或待测菌的菌液为模板，以上述任一所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述基因组DNA或菌液的数字PCR，则待测菌为候选的番茄溃疡病菌；如果所述成套试剂不能实现对所述基因组DNA或菌液的数字PCR，则待测菌为候选的非番茄溃疡病菌。本专利技术所保护的鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法B2)，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA或待测菌的菌液为模板，以上述任一所述引物对Cmm进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对Cmm可以实现对所述基因组DNA或菌液的PCR扩增，则待测菌为候选的番茄溃疡病菌；如果所述引物对Cmm不能实现对所述基因组DNA或菌液的PCR扩增，则待测菌为候选的非番茄溃疡病菌。上述任一所述的方法中，所述待测菌的菌液可为将待测菌株接种至NB液体培养基，培养获得的。上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”的反应体系具体可为20μL，包括10μL2×ddPCRTMsupermixfor本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测番茄溃疡病菌的成套试剂，由引物对Cmm和探针P组成；所述引物对Cmm由引物F和引物R组成；/n所述引物F为如下a1)或a2)：/na1)SEQ ID NO:1所示的单链DNA分子；/na2)将SEQ ID NO:1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO:1具有相同功能的单链DNA分子；/n所述引物R为如下b1)或b2)：/nb1)SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子；/nb2)将SEQ ID NO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO:2具有相同功能的单链DNA分子；/n所述探针P为如下c1)或c2)：/nc1)SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子；/nc2)将SEQ ID NO:3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。/n

【技术特征摘要】
1.检测番茄溃疡病菌的成套试剂，由引物对Cmm和探针P组成；所述引物对Cmm由引物F和引物R组成；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)SEQIDNO:1所示的单链DNA分子；
a2)将SEQIDNO:1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO:1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物R为如下b1)或b2)：
b1)SEQIDNO:2所示的单链DNA分子；
b2)将SEQIDNO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO:2具有相同功能的单链DNA分子；
所述探针P为如下c1)或c2)：
c1)SEQIDNO:3所示的单链DNA分子；
c2)将SEQIDNO:3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。


2.如权利要求1所述成套试剂，其特征在于：所述探针CmmCP的末端具有荧光标记。


3.如权利要求2所述成套试剂，其特征在于：所述探针CmmCP的5′末端具有FAM荧光标记，3′末端具有TAMRA荧光标记。


4.权利要求1所述成套试剂中的所述引物对Cmm。


5.权利要求1至3任一所述成套试剂的应用，为如下d1)或d2)或d3)：
d1)制备用于检测或辅助检测番茄溃疡病菌的试剂盒；
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；
d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。


6.权利要求4所述引物对Cmm的应用，为如下d1)或d2)或d3)：
d1)制备用于检测或辅助检测番茄溃疡病菌的试剂盒；
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；
d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。


7.含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：田茜，张红梅，赵文军，周佩，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11