组合物和方法技术

本公开涉及肾脏类器官及其制造方法。所述类器官和方法可用于多种应用中，例如疾病建模、药物筛选、再生医学和肾细胞的扩大生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组合物和方法专利
本公开涉及肾脏类器官及其制造方法。类器官和方法可用于多种应用，例如疾病建模、药物筛选、再生医学和扩大肾细胞产生。专利技术背景肾脏在清除废物和维持体液量方面起着重要作用。功能性工作单位被称为肾单位。人类肾脏包含多达200万个负责血液过滤的上皮肾单位，所有这些均在出生后产生。在出生后的人类肾脏中不存在肾单位祖细胞。这种祖细胞群体的缺乏不能确保肾单位自我更新的能力，因此，随后的损伤，衰老和疾病可能导致终末期肾病(ESDR)。用于治疗ESDR的有限治疗选择通常会对已经受损的肾脏带来更多压力。肾病晚期唯一可用但昂贵的治疗选择是透析和/或肾脏移植，它们均具有明显的缺点并影响患者的生活质量。人多能干细胞(hPSC)(包括人胚胎干细胞(hES)和人诱导性多能干细胞(hiPS))向不同细胞终点的定向分化已使得能够生成多种人组织(包括肾脏)的类器官模型。先前的类器官模型(例如Takasato等人(2015)Nature,Vol.526:564-568中讨论的那些)价格昂贵，并且可能产生具有复杂三维结构的类器官，从而限制了它们在成像和筛选应用中的使用。这些类器官在培养三周后也可能受到扩散限制，从而限制了它们产生增加的细胞数量的能力和它们成熟的能力。这进而使得当前用于肾脏类器官产生的方案成为用于再生医学或疾病建模的次最佳细胞来源。因此，需要新的肾脏类器官及其制造方法。
技术实现思路
本专利技术人惊奇地鉴定了具有简化的三维结构的肾脏类器官。这种类器官是有利的，因为它们更易于成像和长期培养。因此，在一个实例中，本公开涵盖包含少于50个肾单位的肾脏类器官。在另一个实例中，肾脏类器官包含少于25个肾单位。在另一个实例中，肾脏类器官包含少于15个肾单位。在另一个实例中，肾脏类器官包含5至12个肾单位。在一个实例中，通过在足以促进肾脏类器官发育的条件下使中间中胚层(IM)细胞群体在细胞培养基中涡旋来产生肾脏类器官。在该实例中，IM细胞培养基可包含约180至220ng/ml的FGF9。在一个实例中，通过涡旋0.5×106至1.5×106IM细胞/ml来产生肾脏类器官。在另一个实例中，通过涡旋约0.8至1.2×106IM细胞/ml来产生肾脏类器官。在另一个实例中，肾脏类器官包含表达高水平的肾单位标记物的细胞。在另一个实例中，肾脏类器官包含表达高水平的PAX2、LHX1、SIX1、OSR1、WNT11和GATA3的任一种或多种的细胞。在另一个实例中，肾脏类器官包括表达高水平的PAX2、LHX1、SIX1、OSR1、WNT11和GATA3的细胞。在另一个实例中，肾脏类器官包含表达高水平的PAX2、SIX1、LHX1、OSR1、WNT11、GATA3、PAX8、EYA1和CITED1中的任一种或多种和/或低水平的PDGFRA、MEIS2、WT1和/或C-RET中的任一种或多种的细胞。在另一个实例中，肾脏类器官包含表达高水平的PAX2、LHX1、SIX1、OSR1、WNT11、GATA3、PAX8、EYA1和CITED1的细胞。在另一个实例中，肾脏类器官衍生自选自由以下组成的组的干细胞：H9、hES3、iPSCGAPTraptd-Tomato、CRL1502.C32、CLR1502.3、hES3SOX17mCherry或H9GAPTrapLuc2。在另一实例中，肾脏类器官包含表达低水平的基质标记物的细胞。在另一实例中，肾脏类器官包含表达低水平的PDGFRA、MEIS2、WT1和/或C-RET的细胞。在另一实例中，肾脏类器官包含NPHS+足细胞、LTL+近端区段、ECAD+远端区段、ECAD+/GATA3+集合管或其组合。在另一实例中，肾脏类器官包含约1×104至5×104个细胞。在另一实例中，肾脏类器官包含约1.5×104至2.5×104个细胞。在另一实例中，肾脏类器官的直径为约250至500μm。在另一实例中，肾脏类器官在涡旋培养中保持存活至少十八天。在另一实例中，肾脏类器官在涡旋培养中保持存活至少三周。在另一实例中，肾脏类器官在涡旋培养中保持存活至少四周。在另一实例中，肾脏类器官肾单位包括集合管(GATA3+；ECAD+)、早期远端小管(GATA3-；LTL-；ECAD+)、早期近端小管(LTL+；ECAD-)和肾小球(WT1+)。本专利技术人还惊奇地鉴定了，本文公开的肾脏类器官的细胞在涡旋培养中7天后(例如D7+7)继续分裂。不希望受任何特定理论的束缚，这可能表明使用涡旋培养产生的类器官更适合于治疗应用，例如移植。在另一实例中，本公开涵盖包含本文定义的肾脏类器官的组合物。在另一实例中，本公开涵盖包含本文定义的肾脏类器官或其消化物的组合物。例如，本公开涵盖包含本文定义的肾脏类器官或其酶促消化物的组合物。再次，不希望受任何特定理论的束缚，认为本文公开的肾脏类器官的低复杂性可使它们更适合于生产用于移植的组合物。例如，由低复杂性肾脏类器官产生的组合物可能更倾向于分化成正确的细胞类型，而不是形成畸胎瘤或软骨。在另一实例中，本公开涵盖一种组合物，其包含本文定义的肾脏类器官的酶促消化。在另一实例中，本公开涵盖治疗肾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文定义的组合物。在一个实例中，组合物包含整个类器官。在另一实例中，组合物包含本文公开的类器官的消化物。例如，肾病可以是肾衰竭。在一个实例中，将组合物静脉内施用。在另一实例中，将组合物通过肾动脉注射、肾实质注射、植入或包膜下移植来施用。在另一实例中，本公开涵盖产生肾脏类器官的体外方法，该方法包括在包含FGF的细胞培养基中涡旋中间中胚层(IM)细胞群体。在一实例中，该方法提供了一种用于在体外扩大肾细胞类型的生产的成本有效的手段。在一实例中，将IM细胞在含有FGF、CHIR和肝素的培养基中涡旋。在一实例中，将IM细胞在培养物中涡旋至少5天，其中前24小时包括将细胞在包含FGF、肝素、CHIR和ROCK抑制剂的细胞培养基中涡旋，而接下来的四天包括将细胞在包含FGF、肝素和CHIR的细胞培养基中培养。在该实例中，ROCK抑制剂在前24小时内存在于细胞培养基中，并在随后的几天中不存在于细胞培养基中。在一实例中，细胞培养基包含100至300ng/mlFGF9。在一实例中，细胞培养基包含180至220ng/mlFGF9。在一实例中，细胞培养基包含PVA和MC。在一实例中，前24小时包括将细胞在包含FGF、0.5至1.5μg/ml肝素、0.5至1.5μMCHIR和9至11μMROCK抑制剂的细胞培养基中涡旋。在另一实例中，接下来的四天包括将细胞在包含FGF、0.5至1.5μg/ml肝素和0.5至1.5μMCHIR的细胞培养基中涡旋。在该实例中，接下来的四天细胞培养基中不存在ROCK抑制剂。在另一实例中，接下来的四天包括将细胞在包含FGF9、肝素、CHIR、MC和PVA的细胞培养基中培养。在另一实例中，接下来的四天包括将细胞在包含FGF9、肝素、CHIR，0.05至0.2％MC和0.05至0.2％PVA的细胞培养基中培养。在另一实例中，在培养的剩余天数中，在至少五天后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含少于50个肾单位的肾脏类器官。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171031 AU 20179044241.一种包含少于50个肾单位的肾脏类器官。


2.根据权利要求1所述的肾脏类器官，其包含少于25个肾单位。


3.根据权利要求1所述的肾脏类器官，其包含少于15个肾单位。


4.根据权利要求1所述的肾脏类器官，其包含5至12个肾单位。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的肾脏类器官，其包含表达高水平的PAX2、SIX1、LHX1、OSR1、WNT11、GATA3、PAX8、EYA1和CITED1中的任一种或多种和/或低水平的PDGFRA、MEIS2、WT1和/或C-RET中的任一种或多种的细胞。


6.根据权利要求1至4中任一项所述的肾脏类器官，其包含表达高水平的PAX2、SIX1、LHX1、OSR1、WNT11和GATA3的细胞。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的肾脏类器官，其包含NPHS+足细胞、LTL+近端区段、ECAD+远端区段、ECAD+/GATA3+集合管或其组合。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的肾脏类器官，其中所述类器官衍生自选自由以下组成的组的干细胞：H9、hES3、iPSCGAPTraptd-Tomato、CRL1502.C32、CLR1502.3、hES3SOX17mCherry或H9GAPTrapLuc2。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的肾脏类器官，其包含约1×104至5×104个细胞。


10.根据权利要求1至8中任一项所述的肾脏类器官，其包含约1.5×104至2.5×104个细胞。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的肾脏类器官，其直径为约250至500μm。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的肾脏类器官，其中所述肾脏类器官在涡旋培养中保持存活至少三周。


13.根据权利要求1至11中任一项所述的肾脏类器官，其中所述肾脏类器官在培养中保持存活至少四周。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的肾脏类器官，其中所述类器官肾单元包括集合管(GATA+；ECAD+)、早期远端小管(GATA3-；LTL-；ECAD+)、早期近端小管(LTL+；ECAD-)和肾小球(WT1+)。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的肾脏类器官，其中所述类器官是通过在足以促进肾脏类器官发育的条件下使中间中胚层(IM)细胞群体在细胞培养基中涡旋而产生的。


16.根据权利要求15所述的肾脏类器官，其中所述细胞培养基包含200ng/mlFGF9。


17.根据权利要求15或16所述的肾脏类器官，其中所述肾脏类器官是通过涡旋0.5×106至1.5×106个IM细胞/ml而产生的。


18.根据权利要求15或16所述的肾脏类器官，其中所述肾脏类器官是通过涡旋0.8×106至1.2×106个IM细胞/ml而产生的。


19.一种治疗组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项所述的肾脏类器官或其酶促消化物。


20.一种治疗肾病的方法，其包括将根据权利要求19所述的组合物施用给有此需要的受试者。


21.一种产生肾脏类器官的体外方法，所述方法包括在包含FGF的细胞培养基中涡旋中间中胚层(IM)细胞群体。


22.根据权利要求21所述的方法，其中将所述IM细胞在培养物中涡旋至少5天，其中前24小时包括在包含FGF、肝素、CHIR和ROCK抑制剂的细胞培养基中涡旋细胞，并且接下来的四天包括在包含FGF、肝素和CHIR的细胞培养基中培养细胞。


23.根据权利要求22所述的方法，其中培养的剩余天数包括在包含PVA和MC的细胞培养基中培养细胞。


24.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞培养基包含100至300ng/mlFGF9。


25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述前24小时包括使细胞在包含FGF、0.5至1.5μg/ml肝素、0.5至1.5μMCHIR和9至11μMROCK抑制剂的细胞培养基中涡旋。


26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述接下来的四天包括使细胞在包含FGF、0.5至1.5μg/ml肝素和0.5至1.5μMCHIR的细胞培养基中涡旋。


27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述接下来的四天包括在包含FGF9、肝素、CHIR、MVA和PVC的细胞培养基中培养细胞。


28.根据权利要求27所述的方法，其中所述包含FGF的细胞培养基包含0.05至0.2％MVA和0.05至0.2％PVC。


29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述培养的剩余天数包括在不含FGF、肝...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·利特尔，S·V·库马尔，
申请(专利权)人：默多克儿童研究所，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU