一种肝脏类器官的体外构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种肝脏类器官的体外构建方法及应用，提取小鼠肝细胞诱导构建肝脏类器官，镜下观察其形态，免疫荧光、PCR鉴定其干性和上皮细胞属性进行。建立70%肝切除术后急性肝衰竭小鼠模型，肝脏类器官移植后评估术后第1、4、7天肝功能，比较肝体比，通过HE染色、免疫组化验证肝脏类器官对急性肝衰竭的治疗效果。HE染色、ki‑67染色等炎症及增殖指标显示肝脏类器官移植后增殖明显增强。肝脏类器官具有较强的干性及增殖功能；能够有效缓解70%肝切除术后急性肝衰竭小鼠的肝功能、增加肝体比，通过减轻肝脏炎症浸润、促进70%肝切除术后急性肝衰竭的肝脏再生与修复。

【技术实现步骤摘要】
一种肝脏类器官的体外构建方法及应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种肝脏类器官的体外构建方法及应用。
技术介绍
急性肝衰竭(Acuteliverfailure，ALF)是由病毒、药物、毒素或酒精等因素引起的短时间内大量肝细胞坏死及严重肝脏损伤的临床综合征，常会引起黄疸、肝性脑病、多器官功能衰竭等并发症，死亡率较高。肝移植是目前唯一有效的治疗方法，然而供肝的短缺远无法满足临床的需要，许多患者在等待供肝的过程中死亡。此外，内科治疗只是对症支持治疗，无法改善患者预后，因此迫切需要开发一种替代性的治疗。干细胞在自我更新和分化潜能方面具有独特功能，被视为组织修复和再生的最有发展前景的治疗方法。与肝移植相比，干细胞移植具有侵袭性小、可重复移植治疗等优点，但同时面临植入效率低，植入后细胞存活时间短等问题。有研究表明，3D立体结构有利于细胞的增殖、分化。3D培养能模拟体内细胞外环境，在长期培养中，实现细胞与环境之间高效的能量传递和各种分子信号交流。相比传统细胞2D培养，3D培养的诱导多能干细胞(inductionofpluripotents本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1：制备组织悬液，于无菌条件下取正常小鼠的肝脏，将肝脏进行漂洗后剪碎，得到组织悬液；/nS2：制备细胞悬液，在步骤S1制备的组织悬液中加入肝脏组织消化液，然后转移水浴锅中静置消化，消化后进行机械吹打，待细胞沉淀后收集上清液作为细胞悬液；/nS3：种板，对步骤S2得到的细胞悬液进行过滤、离心、裂解，得到细胞沉淀，采用基质胶重悬细胞沉淀，种于24孔板中央位置，待基质胶固定后，贴壁加入肝脏类器官诱导培养基进行培养，得到初始类器官；/nS4：对步骤S3得到的初始类器官进行传代，选择3~5代作为最终制备的肝脏类器官。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备组织悬液，于无菌条件下取正常小鼠的肝脏，将肝脏进行漂洗后剪碎，得到组织悬液；
S2：制备细胞悬液，在步骤S1制备的组织悬液中加入肝脏组织消化液，然后转移水浴锅中静置消化，消化后进行机械吹打，待细胞沉淀后收集上清液作为细胞悬液；
S3：种板，对步骤S2得到的细胞悬液进行过滤、离心、裂解，得到细胞沉淀，采用基质胶重悬细胞沉淀，种于24孔板中央位置，待基质胶固定后，贴壁加入肝脏类器官诱导培养基进行培养，得到初始类器官；
S4：对步骤S3得到的初始类器官进行传代，选择3~5代作为最终制备的肝脏类器官。


2.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，将肝脏先在预冷的30mLDMEM/F-12培养基中漂洗去除残血，然后在新的30mLDMEM/F-12培养基中剪碎至1mm。


3.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤包括：用移液枪将组织悬液转移至常温50mL离心管中，静置1分钟去除上清，加入10mL肝脏消化液，转移至37度水浴锅中静置消化20分钟，机械吹打后静置1分钟，待细胞沉淀于底部去上清，继续加入10mL肝脏消化液，转移至37度水浴锅中静置消化20分钟，机械吹打后静置1分钟，待细胞沉淀于底部，收集上清于50mL预冷的离心管，继续重复上述消化收集的步骤4次，收集50mL的细胞上清液作为细胞悬液。


4.根据权利要求1或2所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于：所述的肝脏组织消化液的具体配制为：每45mL的DMEM/F12培养基中加入7.5mL的中性蛋白酶和7.5mL的IV型胶原酶。


5.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：施晓雷，王经琳，任昊桢，丁义涛，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32