一种肝脏类器官的体外构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种肝脏类器官的体外构建方法及应用，提取小鼠肝细胞诱导构建肝脏类器官，镜下观察其形态，免疫荧光、PCR鉴定其干性和上皮细胞属性进行。建立70%肝切除术后急性肝衰竭小鼠模型，肝脏类器官移植后评估术后第1、4、7天肝功能，比较肝体比，通过HE染色、免疫组化验证肝脏类器官对急性肝衰竭的治疗效果。HE染色、ki‑67染色等炎症及增殖指标显示肝脏类器官移植后增殖明显增强。肝脏类器官具有较强的干性及增殖功能；能够有效缓解70%肝切除术后急性肝衰竭小鼠的肝功能、增加肝体比，通过减轻肝脏炎症浸润、促进70%肝切除术后急性肝衰竭的肝脏再生与修复。

【技术实现步骤摘要】
一种肝脏类器官的体外构建方法及应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种肝脏类器官的体外构建方法及应用。
技术介绍
急性肝衰竭(Acuteliverfailure，ALF)是由病毒、药物、毒素或酒精等因素引起的短时间内大量肝细胞坏死及严重肝脏损伤的临床综合征，常会引起黄疸、肝性脑病、多器官功能衰竭等并发症，死亡率较高。肝移植是目前唯一有效的治疗方法，然而供肝的短缺远无法满足临床的需要，许多患者在等待供肝的过程中死亡。此外，内科治疗只是对症支持治疗，无法改善患者预后，因此迫切需要开发一种替代性的治疗。干细胞在自我更新和分化潜能方面具有独特功能，被视为组织修复和再生的最有发展前景的治疗方法。与肝移植相比，干细胞移植具有侵袭性小、可重复移植治疗等优点，但同时面临植入效率低，植入后细胞存活时间短等问题。有研究表明，3D立体结构有利于细胞的增殖、分化。3D培养能模拟体内细胞外环境，在长期培养中，实现细胞与环境之间高效的能量传递和各种分子信号交流。相比传统细胞2D培养，3D培养的诱导多能干细胞(inductionofpluripotentstemcells，iPSCs)尿素分泌和白蛋白合成能力明显提高。类器官是在体外基于3D培养系统构建的细胞簇，拥有自动更新和组装的能力，具有体内靶器官的部分功能。现有研究证明干细胞来源的肝脏类器官，植入猪和小鼠体内肝功能维持能力显著增强。Huch等人从人源性肝脏样本中分离出EPCAM+上皮细胞，体外构建成肝脏类器官，经扩增肝脏类器官染色体结构和基因组成保持稳定，具有向肝细胞和胆管细胞分化的潜能，移植到裸鼠体内后能成功分化为功能肝细胞。通过3D培养模式，体外构建类器官移植物是未来急性肝衰竭替代治疗的一个发展方向。基于细胞移植的肝脏疾病治疗方法有了长足的发展，从胚胎干细胞、诱导的多功能干细胞、间充质干细胞到肝祖细胞。尽管从多功能干细胞中诱导能得到肝样干细胞，但因为细胞的分化效率，免疫排斥、伦理问题、致畸风险等问题，临床上应用仍受到限制。并且纯细胞移植虽有一定疗效，但缺乏理想的细胞来源，疗效不确切、不稳定，临床应用有向其他器官浸润的风险，限制了其大规模的推广。目前将细胞与组织工程技术结合是目前研究的热点，而类器官是在体外基于3D培养系统构建的细胞簇，与传统培养模式相比，细胞间、细胞与环境的信号作用进一步增强，拥有自动更新和组装的能力，从而实现体内原始器官的部分功能。目前研究已经证明了在慢性肝脏疾病中，肝祖细胞能介导肝再生，而肝脏类器官具有保护肝细胞、促进肝再生的用。那么在急性肝脏损伤如肝部分切除术后，外源性植入具有类似肝祖细胞属性的肝脏类器官是否发挥促进肝脏再生作用，尚无相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目在于针对现有技术中存在的问题，提供一种肝脏类器官的体外构建方法及应用，提取小鼠肝细胞诱导构建肝脏类器官，镜下观察其形态，免疫荧光、PCR鉴定其干性和上皮细胞属性进行，建立70％肝切除术后急性肝衰竭小鼠模型，肝脏类器官移植后评估术后第1、4、7天肝功能，比较肝体比，通过HE染色、免疫组化验证肝脏类器官对急性肝衰竭的治疗效果。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：一种肝脏类器官的体外构建方法，包括如下步骤：S1：制备组织悬液，于无菌条件下取正常小鼠的肝脏，将肝脏进行漂洗后剪碎，得到组织悬液；S2：制备细胞悬液，在步骤S1制备的组织悬液中加入肝脏组织消化液，然后转移水浴锅中静置消化，消化后进行机械吹打，待细胞沉淀后收集上清液作为细胞悬液；S3：种板，对步骤S2得到的细胞悬液进行过滤、离心、裂解，得到细胞沉淀，采用基质胶重悬细胞沉淀，种于24孔板中央位置，待基质胶固定后，贴壁加入肝脏类器官诱导培养基进行培养，得到初始类器官；S4：对步骤S3得到的初始类器官进行传代，选择3～5代作为最终制备的肝脏类器官。为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：上述步骤S1中，将肝脏先在预冷的30mLDMEM/F-12培养基中漂洗去除残血，然后在新的30mLDMEM/F-12培养基中剪碎至1mm。上述步骤S2的具体步骤包括：用移液枪将组织悬液转移至常温50mL离心管中，静置1分钟去除上清，加入10mL肝脏消化液，转移至37度水浴锅中静置消化20分钟，机械吹打后静置1分钟，待细胞沉淀于底部去上清，继续加入10mL肝脏消化液，转移至37度水浴锅中静置消化20分钟，机械吹打后静置1分钟，待细胞沉淀于底部，收集上清于50mL预冷的离心管，继续重复上述消化收集的步骤4次，收集50mL的细胞上清液作为细胞悬液。上述的肝脏组织消化液的具体配制为：每45mL的DMEM/F12培养基中加入7.5mL的中性蛋白酶和7.5mL的IV型胶原酶。上述步骤S3具体包括：S31：收集的细胞悬液，首先用100um的细胞筛网过滤，留下直径小于100um滤网的细胞，然后将滤液重新用30um的细胞筛过滤，弃去滤液，将30um的滤网倒置于50mL离心管上，用DMEM/F-12培养基冲洗，收集30um滤网上截留的细胞；S32：4度，300g离心5分钟，去上清；S33：加入3～5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻柔吹打，裂解4-5分钟，4度，100g离心5分钟，弃上清，得到细胞沉淀；S34：采用240uL的基质胶重悬细胞沉淀，上下吹打均匀，避免产生气泡，种于24孔板中央8个孔的位置处；S35：37度细胞培养箱静置10分钟，待基质胶固定，贴壁加入750uL肝脏类器官诱导培养基，视培养情况每2～3天更换诱导培养基，得到初始类器官。上述步骤S4具体包括：S41：去除诱导培养基，用PBS轻轻漂洗，去除PBS，加入DMEM/12培养基，静置消化1分钟，机械吹打初始类器官；S42：4度，300g离心5分钟，去上清；S43：枪头预冷，采用240uL基质胶重悬细胞沉淀，上下吹打均匀，避免产生气泡，种于24孔板中央8个孔的位置；S44：37度细胞培养箱静置10分钟，待基质胶固定，贴壁加入750uL肝脏类器官诱导培养基，按1:4的比例进行传代。上述的肝脏类器官诱导培养基的具体配制为：将肝脏类器官基础培养基和肝脏类器官基础培养基添加剂按10:1的体积比混合，并配加抗支原体试剂，混匀后分装，在-20度的温度下保存。本专利技术还保护所述的方法制备的肝脏类器官在治疗急性肝衰竭中的应用。本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术方法制备的小鼠肝脏类器官在体外培养3天直径从20um的囊性结构扩增到约100um的细胞团，肝干性基因EPCAM、SOX9和CK19明显上调，并且EPCAM、SOX9、CK19、TBX3、AFP、SOX17、FOXA2、HNF4A、CEBPA和CEBPB传代前后保持稳定。2.本专利技术通过免疫荧光显示CK8、Desmin、AFP和PCNA呈阳性，肝脏类器官移植后肝体比明显增加，第4天ALT、AST、ALB、TG等肝功能得到恢复。HE染色、ki-67染色等炎症及增殖指标显示肝脏类器官移本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1：制备组织悬液，于无菌条件下取正常小鼠的肝脏，将肝脏进行漂洗后剪碎，得到组织悬液；/nS2：制备细胞悬液，在步骤S1制备的组织悬液中加入肝脏组织消化液，然后转移水浴锅中静置消化，消化后进行机械吹打，待细胞沉淀后收集上清液作为细胞悬液；/nS3：种板，对步骤S2得到的细胞悬液进行过滤、离心、裂解，得到细胞沉淀，采用基质胶重悬细胞沉淀，种于24孔板中央位置，待基质胶固定后，贴壁加入肝脏类器官诱导培养基进行培养，得到初始类器官；/nS4：对步骤S3得到的初始类器官进行传代，选择3~5代作为最终制备的肝脏类器官。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备组织悬液，于无菌条件下取正常小鼠的肝脏，将肝脏进行漂洗后剪碎，得到组织悬液；
S2：制备细胞悬液，在步骤S1制备的组织悬液中加入肝脏组织消化液，然后转移水浴锅中静置消化，消化后进行机械吹打，待细胞沉淀后收集上清液作为细胞悬液；
S3：种板，对步骤S2得到的细胞悬液进行过滤、离心、裂解，得到细胞沉淀，采用基质胶重悬细胞沉淀，种于24孔板中央位置，待基质胶固定后，贴壁加入肝脏类器官诱导培养基进行培养，得到初始类器官；
S4：对步骤S3得到的初始类器官进行传代，选择3~5代作为最终制备的肝脏类器官。


2.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，将肝脏先在预冷的30mLDMEM/F-12培养基中漂洗去除残血，然后在新的30mLDMEM/F-12培养基中剪碎至1mm。


3.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤包括：用移液枪将组织悬液转移至常温50mL离心管中，静置1分钟去除上清，加入10mL肝脏消化液，转移至37度水浴锅中静置消化20分钟，机械吹打后静置1分钟，待细胞沉淀于底部去上清，继续加入10mL肝脏消化液，转移至37度水浴锅中静置消化20分钟，机械吹打后静置1分钟，待细胞沉淀于底部，收集上清于50mL预冷的离心管，继续重复上述消化收集的步骤4次，收集50mL的细胞上清液作为细胞悬液。


4.根据权利要求1或2所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，其特征在于：所述的肝脏组织消化液的具体配制为：每45mL的DMEM/F12培养基中加入7.5mL的中性蛋白酶和7.5mL的IV型胶原酶。


5.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官的体外构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：施晓雷，王经琳，任昊桢，丁义涛，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32