内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用，具体地，本发明专利技术提供了一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法，包括步骤：在第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得功能性的肝母细胞和/或肝实质细胞。本发明专利技术的功能性的肝母细胞和/或肝实质细胞具有非常高的分化率和纯度，并且，本发明专利技术的肝实质细胞还具有有效的治疗肝脏相关疾病的作用。

【技术实现步骤摘要】
内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用
本专利技术涉及生物技术和细胞治疗领域。具体地，本专利技术涉及内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用。
技术介绍
肝脏是人体内的最大分泌腺体，其同时具有内分泌和外分泌功能。内分泌功能主要为分泌多种激素如胰岛素样生长因子、血管紧张肽原、促血小板生成素。与之对应的外分泌功能则为胆汁的合成。肝实质细胞以胆固醇为原料，经多个步骤合成初级胆汁酸，其中关键酶为胆固醇7α-羟化酶。将胆固醇转化为胆汁酸，这是肝脏清除胆固醇的主要方式。此外，肝脏在人体内的重要作用还表现在：(1)糖原储存，肝脏将血液中多余的葡萄糖以肝糖原的形式储存，为机体大量耗能之时提供能量；(2)药物代谢及解毒功能，肝脏内药物代谢及解毒酶类分为①药物代谢一相酶，其主要家族为CYP450超家族，其参与外源及内源有机物质的氧化作用；②药物代谢二相酶，其主要是以一相酶反应产物为底物进行结合反应的催化酶类；③药物代谢三相酶，其主要作用为将肝脏细胞内代谢有毒物质转出肝脏；(3)调节胆固醇的合成和转运；(4)尿素代谢；(5)分泌血清蛋白，幼年肝脏分泌的主要血清蛋白为AFP，在成年肝脏中主要的血清蛋白为ALBUMIN,此外肝脏还分泌血清胰蛋白酶抑制剂AAT。正因肝脏具有如此重要的生理功能，肝炎，肝硬化，急慢性肝衰竭等肝脏疾病致死率高居不下。中国为世界上人口最多的国家，也是乙型肝炎后肝硬化和原发性肝癌的高发国家，每年有50万HBV肝炎新发病例，慢性乙型肝炎症患者达1300万，肝硬化发生率为30.2/10万，重症肝病的发生率在1％-3％之间，如果得不到有效救治，每年约有50多万人死于上述疾病导致的终末期肝病，为家庭和社会带来了严重的经济负担。现阶段对于重症肝病患者最有效的治疗方法为肝脏移植，然而，肝脏供体来源十分短缺，病人往往在肝源等待中丧失了生命。因此，找到新型的治疗方法为亟需解决的问题。近来，肝实质细胞移植性治疗为肝病患者带来了希望，肝实质细胞移植是在体外将游离的、有生物学活性的肝实质细胞以一定的方式直接或间接移植到受体肝脏内，在受体内生长增殖并发挥正常肝实质细胞的作用，以修复受损肝脏或代替部分肝功能。但其仍然面对肝实质细胞资源短缺等严重问题。近年来，科学家们发现可在体外模拟肝脏发育的过程，将胚胎干细胞或是多能诱导干细胞直接分化形成具有肝脏功能的肝实质样细胞，其能够分泌血清白蛋白，以及具有部分CYP酶的解毒功能，但其分化存在以下几点问题：1)安全性问题——任何残留在分化体系中的未分化多能干细胞都有可能在体内形成肿瘤(畸胎瘤/Teratoma)；2)分化细胞的功能问题——由多能干细胞直接分化为功能性细胞十分困难，目前由多能干细胞直接分化的终末分化细胞和成体细胞相比，在功能上都有很大的差距；3)分化细胞的纯度问题——多能干细胞的分化多能性决定了：诱导分化成的目标细胞中会参杂相当比例的同一和其他胚层的细胞类群，因而纯化目标细胞十分困难，同时，也使有关胚层之间相互作用的研究难以进行。近来，日本研究小组报道，将人类胚胎干细胞和脐静脉内皮细胞以及间充质干细胞在体外共培养可诱导分化形成LiverBuds，所得LiverBuds在植入小鼠体内能够形成小型的肝组织。但其所得肝实质细胞仍处于人类肝脏胚胎发育出生前阶段，成熟肝脏相关功能较为缺失。因此，其仍不能满足体外药物筛选平台，终末急性肝脏疾病治疗等应用。随后，GordonKeller实验室报道三维悬浮培养方法结合cAMP信号能够促进由人类胚胎干细胞所得肝实质样细胞的进一步成熟。但其分化过程涉及较多消化处理及细胞重聚等复杂过程，限制了功能性肝实质细胞的规模化制备。此外，目前由病毒性肝炎、药物性肝炎、肝癌等疾病引起的急慢性肝损伤，除肝脏移植外尚无真正有效的治疗方法，死亡率高居不下。然而，近来细胞治疗为肝病患者带来了福音。胚胎干细胞或诱导多能干细胞经体外诱导分化可形成具有一定肝脏功能的肝实质样细胞，但其分化效率低，细胞纯度差，同时具有成瘤的危险。因此，本领域迫切需要开发一种能够规模化制备可用于疾病模型及细胞移植的功能性肝母细胞和/或肝实质细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术公开了一种能够规模化制备可用于疾病模型及细胞移植的功能性肝母细胞和/或肝实质细胞的方法。在本专利技术第一方面，提供了一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法，包括步骤：(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF和BMP4因子；(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞，从而获得肝母细胞；和(c)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得肝实质细胞；其中，所述培养体系包括HGF、OSM、Dex、CompoundE和A83。在另一优选例中，所述的内胚层干细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞。在另一优选例中，所述多能干细胞选自下组：人胚胎干细胞系(如H9、Hes2)、人诱导多能干细胞系(如WT-B5-G7)、或其组合。在另一优选例中，所述的内胚层干细胞选自下组：H9、Hes2、WT-B5-G7、或其组合。在另一优选例中，所述第一培养条件含有第一培养基。在另一优选例中，所述第一培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。在另一优选例中，在步骤(b)中，所述培养体系为含有第二培养基和添加物的培养液，所述添加物包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子。在另一优选例中，所述第二培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。在另一优选例中，所述第二培养条件含有第三培养基。在另一优选例中，所述第三培养基选自下组：HCM、SFD、DMEM/F12、或其组合。在另一优选例中，在步骤(a)中，将内胚层干细胞在第一培养条件下培养2-10天，较佳地，3-8天，更佳地，6-7天。在另一优选例中，在步骤(b)中，将肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞培养2-10天，较佳地，3-8天，更佳地，6-7天。在另一优选例中，在步骤(c)中，将肝母细胞在第二培养条件下培养10-30天，较佳地，15-20天，更佳地，18-19天。在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：(i)高肝母细胞和/或肝实质细胞分化率，所述分化率为80-98％，较佳地，90-95％；(ii)在培养过程中，每1ml的培养液中接种1×106个内胚层干细胞，可产生15×106或8×106个肝母细胞和/或肝实质细胞。在另一优选例中，在步骤(a)－(c)中，所述培养体系中还含有促进分化的其他物质，选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(Basem本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法，其特征在于，包括步骤：/n(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；/n(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞，从而获得肝母细胞；和/n(c)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得肝实质细胞；其中，所述培养体系包括HGF、OSM、Dex、Compound E、和/或A83。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝母细胞和/或肝实质细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；
(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞，从而获得肝母细胞；和
(c)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得肝实质细胞；其中，所述培养体系包括HGF、OSM、Dex、CompoundE、和/或A83。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述培养体系为含有第二培养基和添加物的培养液，所述添加物包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)－(c)中，所述培养体系中还含有促进分化的其他物质，选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(BasementMembraneExtracts)、或其组合。


4.一种肝母细胞，其特征在于，所述肝母细胞为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述肝母细胞的球囊直径大小300－500μm，球囊表面肝母细胞大小60-80μm，细胞层厚度6－12μm。


5.一种肝实质细胞，其特征在于，所述肝实质细胞为封闭的具...

【专利技术属性】
技术研发人员：程新，冯思思，吴佳颖，邓小刚，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：上海;31