单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法技术

本发明专利技术提供一种单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，所述方法包括在Transwell嵌套上室铺设胶原蛋白，并调整奶牛乳腺上皮细胞的培养基组成及培养时间。相较于现有的细胞培养方法，本发明专利技术成功构建了奶牛乳腺上皮屏障模型，可在研究奶牛患乳房炎时乳腺组织被破坏的机理、乳汁物质运输及不同物质对乳腺上皮屏障的保护作用等方面广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法。
技术介绍
在哺乳动物乳腺中，乳腺上皮细胞是乳腺表层的第一层细胞，不仅可以分泌乳汁还能对大肠杆菌等抗原产生先天性免疫反应。相邻的乳腺上皮细胞通过细胞连接复合体连接在一起，细胞连接复合体包括紧密连接(Tightjunction，TJ)、粘附连接(Adhesionjunction，AJ)和桥粒(Desmosome)。其中紧密连接位于上皮细胞最顶端的连接复合物，呈连续的带状结构，使相邻的上皮细胞互相紧密连接，限制水分子、离子、水和微生物的胞旁流动，是血乳屏障的重要组成部分。桥粒是一种坚韧、牢固的细胞连接结构，通过与中间纤维形成的网络支架相连，使相邻的细胞连接成一体，可以承受很大的拉力，且桥粒本身即具有很强的抗牵张力，使得细胞间的连接更为牢固。乳房炎是哺乳动物常见的一种危害较大的临床性疾病，奶牛乳腺感染细菌会扰乱其乳腺上皮细胞正常分泌乳汁的功能，导致乳汁中断。急性乳房炎常常损伤血乳屏障，而屏障功能被破坏后，乳汁中的成分如α-乳清蛋白和酪蛋白会进入血液，血液中的成分也会进入乳汁。因此，亟需开发一种新的细胞培养方法，用于奶牛乳腺上皮屏障模型的构建。单层细胞跨膜电阻值(TransEpithelialElectricResistance，TEER)用于评价单层细胞的完整性，通常认为TEER值在达到400Ω·cm2时即表明形成了致密的单层细胞。
技术实现思路
本专利技术旨在利用奶牛乳腺上皮细胞，提供一种新的单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，在为研究奶牛患乳房炎时乳腺组织被破坏的机理、乳汁物质运输及不同物质对乳腺上皮屏障的保护作用提供一种致密的单层奶牛乳腺上皮细胞模型。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，将奶牛乳腺上皮细胞接种于上室铺设有胶原蛋白的带膜Transwell嵌套多孔板中，随后进行两阶段的细胞培养，即奶牛乳腺上皮细胞接种后48h内采用培养基1进行培养，随后72h采用培养基2进行培养。其中，培养基1为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、15ng/mL人表皮生长因子、1％ITS的DMEM/F12培养基。其中，％是指体积百分数。培养基2为含有5％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1％ITS的DMEM/F12培养基。ITS为含有1g/L胰岛素、0.55g/L转铁蛋白、0.00067g/L亚硒酸钠的溶液。即，ITS溶液(100×)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。前述的方法，将奶牛乳腺上皮细胞以104～105个/孔(优选2×104个/孔)接种于上室铺设有胶原蛋白的带膜Transwell嵌套多孔板的上室中，于37℃、5％CO2条件下培养。前述的方法，采用培养基1进行培养时，每24h更换一次培养基。前述的方法，采用培养基2进行培养时，每48h更换一次培养基。前述的方法，所述胶原蛋白的浓度为0.012mg/mL。优选地，所述胶原蛋白为鼠尾胶原蛋白(鼠尾胶原)，用于包被多孔板的胶原蛋白溶液以0.36g/L乙酸溶液进行配制。优选地，所述带膜Transwell嵌套多孔板为12孔板。所述带膜Transwell嵌套多孔板中膜的材质为聚酯膜，嵌套直径为6.5mm，嵌套膜生长面积为0.33cm2，膜的孔径为0.4μm，膜厚度为10μm。本专利技术中，奶牛乳腺上皮细胞接种于Transwell上室，上室加200μL培养基，下室加600μL培养基；细胞接种前，Transwell上、下室需要加入细胞培养基1进行平衡。第二方面，本专利技术提供按照上述方法培养获得的单层致密奶牛乳腺上皮细胞作为奶牛乳腺上皮细胞屏障模型。可选地，模型采用TEER对单层细胞的致密程度进行评价。例如，细胞接种后，每隔48h使用细胞电阻仪(如美国Millipore细胞电阻仪MERS00002)测定单层细胞的TEER，TEER达到400Ω·cm2即认为符合要求。可选地，模型采用透射电镜(TEM)对奶牛乳腺上皮细胞之间的桥粒结构进行检测。可选地，模型采用免疫荧光染色的方法对紧密连接蛋白(ZO-1)进行检测。乳腺上皮细胞中的细胞-细胞黏附复合物示意图见图1。本专利技术技术路线图见图2。该模型可用于奶牛患乳房炎时乳腺组织的破坏机理、乳汁物质运输以及不同物质对乳腺上皮屏障的保护作用等方面的研究。本专利技术提供一种新的奶牛乳腺上皮细胞培养方法，并成功构建了奶牛乳腺上皮屏障模型，所述方法包括在Transwell嵌套上室铺设胶原蛋白，并调整奶牛乳腺上皮细胞的培养基组成及培养时间。本专利技术在Transwell上室铺设胶原蛋白，并在细胞铺满培养皿底部后，去除培养基中的人表皮生长因子，降低胎牛血清浓度，使奶牛乳腺上皮细胞之间形成紧密连接和桥粒结构，为奶牛患乳房炎时乳腺组织被破坏的机理、乳汁物质运输及不同物质对乳腺上皮屏障的保护作用等相关的试验研究提供体外细胞模型。附图说明图1为本专利技术乳腺上皮细胞中的细胞-细胞黏附复合物示意图。图2为本专利技术技术路线图。图3为本专利技术实施例1中单层奶牛乳腺上皮细胞TEER变化图。图4为本专利技术实施例1中奶牛乳腺上皮细胞间的桥粒结构TEM示意图。图中圈圈表示细胞桥粒结构。图5为本专利技术实施例1中紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光染色图。图6为本专利技术实施例2中干酪乳杆菌Zhang处理前后单层上皮细胞TEER的变化。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中使用的ITS为含有1g/L胰岛素、0.55g/L转铁蛋白和0.00067g/L亚硒酸钠的溶液。即，ITS溶液(100ⅹ)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。鼠尾胶原购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。实施例1奶牛乳腺上皮细胞培养方法本实施例的目的是提供一种奶牛乳腺上皮细胞培养方法，为深入研究奶牛患乳房炎时乳腺组织被破坏的机理、乳汁物质运输及不同物质对乳腺上皮屏障的保护作用提供一种致密的单层奶牛乳腺上皮细胞模型。包括以下步骤：1、Transwell胶原蛋白的铺设与平衡(1)0.006mol/L(0.36g/L)乙酸的配制：取36μL分析纯乙酸(冰醋酸)，溶于100mL灭菌的去离子水中备用。(2)0.012mg/mL胶原蛋白的配制：取17μL鼠尾胶原(3.52mg/mL)，溶于上述0.006mol/L乙酸中。(3)取上述0.012mg/mL胶原蛋白50μL均匀涂布于Transwell嵌套上室(膜生长面积为0.33cm2)，置于37℃培养箱中过夜。(4)使用前至少1h先将600μL培养液加入12孔板中，再将铺设好胶原蛋白的嵌套放入，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，其特征在于，将奶牛乳腺上皮细胞接种于上室铺设有胶原蛋白的带膜Transwell嵌套多孔板中，随后进行两阶段的细胞培养，即奶牛乳腺上皮细胞接种后48h内采用培养基1进行培养，随后72h采用培养基2进行培养；/n其中，培养基1为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、15ng/mL人表皮生长因子、1％ITS的DMEM/F12培养基；/n培养基2为含有5％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1％ITS的DMEM/F12培养基；/nITS为含有1g/L胰岛素、0.55g/L转铁蛋白和0.00067g/L亚硒酸钠的溶液。/n

【技术特征摘要】
1.单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，其特征在于，将奶牛乳腺上皮细胞接种于上室铺设有胶原蛋白的带膜Transwell嵌套多孔板中，随后进行两阶段的细胞培养，即奶牛乳腺上皮细胞接种后48h内采用培养基1进行培养，随后72h采用培养基2进行培养；
其中，培养基1为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、15ng/mL人表皮生长因子、1％ITS的DMEM/F12培养基；
培养基2为含有5％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1％ITS的DMEM/F12培养基；
ITS为含有1g/L胰岛素、0.55g/L转铁蛋白和0.00067g/L亚硒酸钠的溶液。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将奶牛乳腺上皮细胞以104～105个/孔接种于上室铺设有胶原蛋白的带膜Transwell嵌套多孔板的上室中，于37℃、5％CO2条件下培养。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用培养基1进行培养时，每24h更换一次培养基。


4.根据权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李胜利，郑宇慧，刘钢，王蔚，曹志军，杨红建，王雅晶，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11