一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法。所述方法为将含有细胞的样本铺在装有完全培养基的培养皿中，在完全培养基中添加无外泌体血清和青霉素和链霉素，培养后收集细胞上清；膜过滤器预处理后离心取上清，用等体积的PEG6000混合，低温孵育，然后离心,去上清，沉淀重悬PBS中；透析；离心，不连续的碘克沙醇梯度处理；再离心，从梯度顶部收集等体积的12个组分；然后对碘克沙醇梯度6‑9组分的外泌体进行低温高速离心取沉淀即为纯化后的外泌体。采用本发明专利技术的方法得到的外泌体纯度高且耗时较短。

A method of high purity exosomes density gradient centrifugation

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法
本专利技术涉及生物质纯化领域，尤其涉及一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法。
技术介绍
外泌体(exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小囊泡。它广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。作为人体内的一类重要囊泡，外泌体自2013年起逐步成为科研热点。当前有多种纯化提取外泌体的方法,最经典的外泌体分离方法是超速离心法，超速离心法是通过外泌体与其他生物组分密度的微小差异进行分离，该方法分离得到的外泌体纯度较高，但是耗时较长且回收率不稳定，得率较低，重复离心可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低质量。还有常用的密度梯度离心法，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于,包含如下步骤：/nS1、用膜过滤器预处理细胞上清或含有外泌体的液体样本，第一次离心取上清；增加转速第二次离心取上清；/n优选的，用0.22μm膜过滤器预处理细胞上清，2000×g，离心10min,取上清；10000×g离心30min,取上清；/nS2、用等体积的PEG6000与上清混合，低温孵育，然后离心,去上清，沉淀重悬PBS中；/n优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，2-6℃孵育1-3h，然后3000×g离心8-12min,去上清，沉淀重悬于PBS中；/n更优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，4℃孵育2h，然后...

【技术特征摘要】
1.一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于,包含如下步骤：
S1、用膜过滤器预处理细胞上清或含有外泌体的液体样本，第一次离心取上清；增加转速第二次离心取上清；
优选的，用0.22μm膜过滤器预处理细胞上清，2000×g，离心10min,取上清；10000×g离心30min,取上清；
S2、用等体积的PEG6000与上清混合，低温孵育，然后离心,去上清，沉淀重悬PBS中；
优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，2-6℃孵育1-3h，然后3000×g离心8-12min,去上清，沉淀重悬于PBS中；
更优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，4℃孵育2h，然后3000×g离心10min,去上清，沉淀重悬于1mLPBS中；
S3、将上述重悬液加到透析袋中透析；透析后的样本高速低温离心；
优选的，将上述重悬液加到10KD的透析袋中，透析1h；透析后的样本在100000×g条件下，4℃离心17min；
S4、透析后所得使用不连续的碘克沙醇梯度进行处理；
优选的，透析后所得添加40％碘克沙醇溶液，然后仔细分层1.2mL20％、10％和5％碘克沙醇溶液，形成梯度；
S5、低温高速离心，从梯度顶部收集等体积的12个...

【专利技术属性】
技术研发人员：董康梅，叶国栋，陈茂立，许剑雄，
申请(专利权)人：厦门生命互联科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35