一种肝细胞培养基、培养方法及其用途技术

本发明专利技术涉及原代细胞体外培养领域，特别是涉及一种肝细胞培养基、培养方法及其用途。所述肝细胞培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基包括以下成分：液体基础培养基、半乳糖、胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠、脯氨酸、烟酰胺、鸟氨酸、转化生长因子α、表皮生长因子、地塞米松、Y‑27632、A‑83‑01、CHIR99021。本发明专利技术建立了原代肝细胞的长期体外扩增体系；肝细胞传代扩增培养时完全分化而不发生细胞退分化或转分化，降低了致癌风险，而且诱导成熟的肝细胞与原代肝细胞的肝功能差异小。

A culture medium, method and application of hepatocytes

【技术实现步骤摘要】
一种肝细胞培养基、培养方法及其用途
本专利技术涉及原代细胞体外培养领域，特别是涉及一种肝细胞培养基、培养方法及其用途。
技术介绍
肝细胞的体外培养对于推进肝脏细胞疗法、肝细胞死亡和肝脏再生机制以及肝脏疾病药物研究等都具有重要的意义。目前已经报道了几种可以对肝细胞进行体外培养的方法，如TakeshiKatsuda课题组在2016年报道，可以通过在培养基中添加化学小分子Y-27632、A-83-01和CHIR99021实现大鼠和小鼠肝细胞的体外扩增，培养的细胞退分化为具有双潜能性的肝祖细胞，经过进一步诱导可以分化为肝细胞或胆管细胞。2018年，中国科学院上海生化细胞研究所惠利健课题组发现并报道，HM培养基可以诱导人肝细胞在体外以双潜能的形式传代扩增培养。2019年，北京大学邓宏魁教授实验室报道了一种通过添加5种小分子化合物使原代肝实质细胞在体外长期(大于4周)稳定培养的技术，然而该技术只能用于维持培养中的肝细胞的性能，而不能用于肝细胞的体外扩增。前期的这些报道揭示了肝细胞体外扩增培养的挑战性。目前已建立的肝细胞体外培养系统还不能实现真正的肝细胞体外扩增培养，而只能以先退分化传代再诱导其分化为目的细胞的形式进行。诱导成熟后的肝细胞虽然具有一定的肝功能，但是与原代肝细胞相比仍具有明显的差异。同时诱导的肝细胞存在分化不完全的可能性，因而具有潜在的致瘤风险。基于这样的技术背景，建立功能性肝细胞长期体外传代培养的培养体系，实现肝细胞在长期传代的过程中仍保持其完全分化特征和功能是目前亟待解决的难题。专利
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种肝细胞培养基、培养方法及其用途，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种肝细胞培养基，所述培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基以增殖培养基总量为基础计，包括以下成分：液体基础培养基优选地，所述肝细胞培养基还包括成熟培养基，所述成熟培养基以成熟培养基的总量为基础计，包括以下成分：液体基础培养基优选地，所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯可林。优选地，所述弗斯可林的浓度为0.1μM～100μM，优选为1～50μM优选地，所述肝细胞培养基中胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠为胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠的混合制剂。优选地，所述Y-27632为Rho相关蛋白激酶抑制剂。优选地，所述A-83-01为转化生长因子-β通路抑制剂。优选地，所述CHIR99021为Wnt通路活化剂。优选地，所述半乳糖的浓度为1.0～2.0g/L，更优选为1.6～2g/L；优选地，所述脯氨酸的浓度为：0.1～1.0g/L，更优选为0.1～0.5g/L；优选地，所述鸟氨酸的浓度为：0.01～0.3g/L，更优选为0.05～0.15g/L；优选地，所述烟酰胺的浓度为：0.4～0.8g/L，更优选为0.5～0.7g/L；优选地，所述转化生长因子α的浓度为10～80ng/mL，更优选为20-40ng/mL。本专利技术第二方面提供一种肝细胞培养基在培养肝细胞中的方法，包括以下步骤：1)用含FBS的基础培养基培养原代肝细胞，使其贴壁；2)去除未贴壁的细胞，更换为增殖培养基扩增培养；3)细胞使用前更换为成熟培养基培养。较佳的，细胞使用前5～7天更换成熟培养基。本专利技术第三方面提供一种肝细胞，所述肝细胞为原代肝细胞经第二方面所述的肝细胞培养方法中，采用所述步骤1)和所述步骤2)长期扩增培养后获得的仍保持完全分化的肝细胞，或为原代肝细胞经第二方面所述的肝细胞培养方法培养获得的成熟的肝细胞。本专利技术第四方面提供一种肝细胞的用途，所述肝细胞在体外研究肝细胞死亡、增殖机制、肝细胞疗法、肝细胞移植、制备生物人工肝、肝脏疾病机制研究、肝脏疾病药物的开发、筛选、药理毒理学评价中的用途。如上所述，本专利技术的一种肝细胞培养基、培养方法及其用途，具有以下有益效果：1)建立了原代肝细胞的长期体外扩增体系；2)原代肝细胞传代培养时完全分化而不发生细胞退分化或转分化，降低了致癌风险。3)诱导成熟的肝细胞与原代肝细胞的肝功能差异小。附图说明图1-a显示为HMM培养基和本专利技术的YACD培养基培养的小鼠原代肝细胞增殖曲线。图1-b显示为HMM培养基和YACD培养基培养的不同天数的小鼠原代肝细胞明场显微镜下观察的小鼠原代肝细胞，标尺为100μm。图2显示为YACD培养基培养的不同代数的小鼠肝细胞明场显微镜下观察的不同代数的小鼠肝细胞，标尺为100μm。图3-1显示为小鼠原代肝细胞和YACD培养基培养5代的肝细胞重要肝功能标志基因的表达水平比较。图3-2显示为小鼠原代肝细胞和YACD培养基培养11代的肝细胞重要肝功能标志基因的表达水平比较。图4显示为YACD培养基培养不同代数的小鼠肝细胞Albumin蛋白免疫荧光染色后荧光显微镜下拍摄的照片，标尺为50μm。图5显示为YACD培养基培养5代的小鼠肝细胞PAS染色后，显微镜下观察染色结果，标尺为100μm。图6显示为小鼠原代肝细胞和YACD培养基培养5代的肝细胞CK19的表达水平。图7显示为YACD培养基和ODF培养基培养的小鼠肝细胞功能基因的表达水平。图8显示为ODF培养基诱导7天后的肝细胞与原代肝细胞肝功能基因的表达水平比较。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。本专利技术第一方面提供一种肝细胞培养基，所述培养基包括增殖培养基和/或成熟培养基，所述增殖培养基包括以下成分：液体基础培养基所述成熟培养基包括以下成分：液体基础培养基其中，所述液体基础培养基可以为MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640、F12中的一种或几种，在一较佳实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝细胞培养基，其特征在于，所述肝细胞培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基以增殖培养基总量为基础计，包括以下成分：/n

【技术特征摘要】
1.一种肝细胞培养基，其特征在于，所述肝细胞培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基以增殖培养基总量为基础计，包括以下成分：





2.根据权利要求1所述的肝细胞培养基，还进一步包括成熟培养基，所述成熟培养基以成熟培养基的总量为基础计，包括以下成分：





3.根据权利要求2所述的肝细胞培养基，其特征在于，所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯可林。


4.根据权利要求3所述的肝细胞培养基，其特征在于，所述弗斯可林的浓度为0.1μM-100μM，优选为1～50μM。


5.根据权利要求1或2所述的肝细胞培养基，其特征在于，所述液体基础培养基为MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640、F12中的一种或几种。


6.根据权利要求1或2所述的肝细胞培养基，其特征在于，还包括以下项中的一种或几种：
1)所述半乳糖的浓度为1.0～2.0g/L，优选为1.6～2g/L；
2)所述脯氨酸的浓度为：0.1～1.0g/L，优选为0.1～0.5g/L；
3)所述鸟氨酸的浓度为：0.01～0.3g/L，优选为0.05～0.15g/L；...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹏羽，毛一雷，庄绪冉，刘俊来，彭文博，
申请(专利权)人：上海科技大学，中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：上海;31