一种两栖类动物细胞解离试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种两栖类动物细胞解离试剂盒。本发明专利技术的试剂盒包括以下试剂：试剂C含有胶原酶Ⅰ和分散酶Ⅱ，浓度依次为43000‑53000U/100ml、90‑110units/100ml；试剂D含有胶原酶Ⅰ，浓度为55000‑65000U/100ml。试剂E含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，浓度依次为120000‑180000USPU/100ml、0.03‑0.07g/100ml。试剂F含有胶原酶Ⅱ，浓度为50000‑55000U/100ml。本发明专利技术还保护一种解离两栖动物组织获得单细胞的方法：皮肤组织，剪碎，用试剂C处理；肌肉组织，剪碎，先加入试剂D处理，再加入试剂E处理；骨骼组织，切碎，用试剂F处理。本发明专利技术可以应用到各种两栖动物肢体皮肤、肌肉，骨骼组织的单细胞研究。

【技术实现步骤摘要】
一种两栖类动物细胞解离试剂盒
本专利技术涉及一种两栖类动物细胞解离试剂盒。
技术介绍
以蝾螈为代表的诸多两栖动物具有强大的再生能力，但是由于其自身特性如细胞渗透压、生活适应温度与哺乳动物有较大差异，其细胞分离和培养方法丞待突破。现在以两栖类动物为实验对象的实验室多数以组织整体为研究对象，缺少对细胞异质性的探索，在一些科学问题上停滞不前。且对哺乳动物而言最常见的将组织或培养的细胞解离成单细胞的方法就是酶解的方法，而胰酶因为价格便宜、作用强，成为现在实验室最常用酶。现有技术中存在的问题如下：(1)若以哺乳动物各类型的细胞解离方法，则存在解离温度不适宜，无法控制酶的活性，细胞难以维持和体内相同的状态，若以此为研究对象并不能确保实验结果的真实性；(2)解离效率不高，为了达到研究要求，需要解离更多组织，增加实验成本；(3)胰酶本身作用比较强，容易造成细胞膜损伤，引起细胞凋亡，难以保证细胞活率，不利于后续研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种两栖类动物细胞解离试剂盒。本专利技术要求保护一种用于解离两栖类动物组织获得细胞的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：试剂C、试剂D、试剂E和试剂F。所述试剂C含有胶原酶Ⅰ和分散酶Ⅱ，胶原酶Ⅰ的浓度为43000-53000U/100ml,分散酶Ⅱ的浓度为90-110units/100ml。所述试剂D含有胶原酶Ⅰ，胶原酶Ⅰ的浓度为55000-65000U/100ml。所述试剂E含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为120000-180000USPU/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml。试剂F含有胶原酶Ⅱ，胶原酶Ⅱ的浓度为50000-55000U/100ml。所述试剂C含有胶原酶Ⅰ和分散酶Ⅱ，胶原酶Ⅰ的浓度为48000U/100ml,分散酶Ⅱ的浓度为100units/100ml。所述试剂D含有胶原酶Ⅰ，胶原酶Ⅰ的浓度为60000U/100ml。所述试剂E含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为150000USPU/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml。试剂F含有胶原酶Ⅱ，胶原酶Ⅱ的浓度为52200U/100ml。所述试剂C含有胶原酶Ⅰ和分散酶Ⅱ，胶原酶Ⅰ的浓度为0.1-0.3g/100ml,分散酶Ⅱ的浓度为0.1-0.3g/100ml。所述试剂D含有胶原酶Ⅰ，胶原酶Ⅰ的浓度为0.2-0.3g/100ml。所述试剂E含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为0.4-0.6g/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml。试剂F含有胶原酶Ⅱ，胶原酶Ⅱ的浓度为0.1-0.3g/100ml。所述试剂C含有胶原酶Ⅰ和分散酶Ⅱ，胶原酶Ⅰ的浓度为0.2g/100ml,分散酶Ⅱ的浓度为0.2g/100ml。所述试剂D含有胶原酶Ⅰ，胶原酶Ⅰ的浓度为0.25g/100ml。所述试剂E含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为0.5g/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.05g/100ml。试剂F含有胶原酶Ⅱ，胶原酶Ⅱ的浓度为0.2g/100ml。所述试剂盒可用于从两栖类动物的皮肤、肌肉和骨骼中解离获得细胞。本专利技术还保护所述试剂盒的应用，为解离两栖类动物的器官或组织获得细胞。本专利技术还保护一种用于解离两栖类动物皮肤组织获得细胞的试剂盒，包括以上任一所述的试剂C。本专利技术还保护试剂盒的应用，为解离两栖类动物皮肤组织获得细胞。本专利技术还保护一种用于解离两栖类动物肌肉组织获得细胞的试剂盒，包括以上任一所述的试剂D和试剂E。本专利技术还保护试剂盒的应用，为解离两栖类动物肌肉组织获得细胞。本专利技术还保护一种用于解离两栖类动物骨骼组织获得细胞的试剂盒，包括以上任一所述的试剂F。本专利技术还保护试剂盒的应用，为解离两栖类动物骨骼组织获得细胞。以上任一所述试剂盒还可包括试剂A和/或试剂B。试剂A为清洗试剂。试剂B为预处理试剂。试剂B中含有0.05-0.15g/100ml金属离子螯合剂。试剂B中具体含有0.1g/100ml金属离子螯合剂。以上任一所述金属离子螯合剂具体可为EDTA-Na2。EDTA-Na2具体可以以纯品的方式提供，也可以通过水合化合物的方式提供。以上任一所述试剂C可以由胶原酶Ⅰ、分散酶Ⅱ和试剂A组成。以上任一所述试剂D可以由胶原酶Ⅰ和试剂A组成。以上任一所述试剂E可以由含有胰蛋白酶、金属离子螯合剂和试剂A组成。以上任一所述试剂F可以由胶原酶Ⅱ和试剂A组成。以上任一所述试剂A含有3-4mg/100ml硫酸庆大霉素、80-120单位/ml青霉素(碱)和80-120μg/ml链霉素(碱)。以上任一所述试剂A含有3.5mg/100ml硫酸庆大霉素、100单位/ml青霉素(碱)和100μg/ml链霉素(碱)。以上任一所述试剂A由硫酸庆大霉素、青霉素(碱)、链霉素(碱)、DPBS和无酶水组成。以上任一所述试剂A的制备方法具体可为按照表2取各个原料，充分溶解混匀，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为试剂A。本专利技术还保护一种解离两栖动物组织获得单细胞的方法，包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，用所述试剂C进行处理；取肌肉组织，剪碎，先加入所述试剂D进行处理，再加入所述试剂E进行处理；取骨骼组织，切碎，用所述试剂F进行处理。解离两栖动物组织获得单细胞的方法具体包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，置于试剂C中，室温浸泡1-3h，然后加入2倍体积的含10％血清的α-MEM培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-MEM培养基重悬；取肌肉组织，剪碎，置于试剂D中，室温浸泡1-2h，然后加入等体积试剂E并继续室温浸泡20min，然后加入2倍体积的含10％血清的α-MEM培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-MEM培养基重悬；取骨骼组织，在试剂A中清洗三次(每次3min)，然后用手术刀将其切碎成约1mm3的小块，然后置于试剂F中，室温浸泡1.5-2h(此时，组织块基本消失，溶液变浑浊)，然后加入2倍体积的含10％血清的α-MEM培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-MEM培养基重悬。本专利技术还保护一种解离两栖类动物皮肤组织获得细胞的方法，包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，用所述的试剂C进行处理。具体包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，置于试剂C中，室温浸泡1-3h，然后加入2倍体积的含10％血清的α-MEM培养基以终止消化，然后用70μm细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于解离两栖类动物组织获得细胞的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：试剂C、试剂D、试剂E和试剂F；/n所述试剂C含有胶原酶Ⅰ和分散酶Ⅱ，胶原酶Ⅰ的浓度为43000-53000U/100ml,分散酶Ⅱ的浓度为90-110units/100ml；/n所述试剂D含有胶原酶Ⅰ，胶原酶Ⅰ的浓度为55000-65000U/100ml；/n所述试剂E含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为120000-180000USP U/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml；/n试剂F含有胶原酶Ⅱ，胶原酶Ⅱ的浓度为50000-55000U/100ml。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于解离两栖类动物组织获得细胞的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：试剂C、试剂D、试剂E和试剂F；
所述试剂C含有胶原酶Ⅰ和分散酶Ⅱ，胶原酶Ⅰ的浓度为43000-53000U/100ml,分散酶Ⅱ的浓度为90-110units/100ml；
所述试剂D含有胶原酶Ⅰ，胶原酶Ⅰ的浓度为55000-65000U/100ml；
所述试剂E含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为120000-180000USPU/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml；
试剂F含有胶原酶Ⅱ，胶原酶Ⅱ的浓度为50000-55000U/100ml。


2.权利要求1所述试剂盒的应用，为解离两栖类动物组织获得细胞。


3.一种用于解离两栖类动物皮肤组织获得细胞的试剂盒，包括权利要求1中所述的试剂C。


4.权利要求3所述试剂盒的应用，为解离两栖类动物皮肤组织获得细胞。


5.一种用于解离两栖类动物肌肉组织获得细胞的试剂盒，包括权利要求1所述的试剂D和试剂E。


6.权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晨，黎瀚博，刘田宾，刘姗姗，范广益，顾颖，刘心，徐讯，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，青岛华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44