一种大规模干细胞培养方法和设备技术

本发明专利技术提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5‑10mm，微囊的孔径为10nm‑10000nm；将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1‑8×10

【技术实现步骤摘要】
一种大规模干细胞培养方法和设备
本专利技术属于干细胞
，特别涉及一种大规模干细胞培养方法和设备。
技术介绍
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞，干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域，现有的干细胞培养多是在实验室小规模培养，当扩大规模时，收获困难，因此急需一种能够易于收获的大规模干细胞培养的方法。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种大规模干细胞培养方法。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5-10mm，微囊的孔径为10nm-10000nm；将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1-8×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1-3天，静态培养时的搅拌速度调至50-70RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37±1℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3-5天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为1-3vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；用3D微胶囊溶解剂进行解囊；收获扩增细胞。其中，扩增培养基包括所有用于细胞扩增的培养基，当待培养的干细胞为间充质干细胞时，培养基优选为DMEM/F12培养基，本专利技术提供的3D微胶囊支持多种贴附依赖性细胞(贴壁细胞)、兼性贴壁细胞等绝大多数细胞类型的高效生产和收获，包括：成纤维型细胞(内皮细胞、间充质细胞、成骨细胞、心肌细胞、软骨细胞等)、上皮型细胞(皮肤细胞、表皮衍生物、消化管上皮细胞等)、游走型细胞(巨噬细胞、肿瘤细胞等)、多形性型细胞(神经元细胞、神经胶质细胞等)等,扩增细胞的收获方法根据具体情况而定，如采用ATF2细胞截留设备收获，本专利技术采用以上方法能够提高细胞大规模培养时的细胞得率。进一步地，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为30-50r/min。进一步地，步骤(2)溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为100-1000g/L，静置3-5h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1-2:1-2。进一步地，3D微胶囊的制备方法为：S1：将重量百分比为1-6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1-5wt％的明胶溶液以0.1-2:0.1-2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；S2：在第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，起泡剂在第一混合溶液中的浓度为5-100g/L，制得第二混合溶液；S3：在第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，CaCl2溶液与第一混合溶液的体积比为1-2:1-2，制得3D微胶囊溶液；S4：将3D微胶囊溶液用生理盐水洗涤3-6次，在进行真空干燥，制得干燥3D微胶囊；S5：将干燥3D微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊。进一步地，3D微胶囊溶解剂包括质量比为0.1-1.0:0.1-2.0:0.1-1.0:0.1-2.0的氨基酸+柠檬酸+柠檬酸钠+EDTA钠盐，氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、氨基酸、精氨酸和组氨酸中的任意一种。进一步地，溶解剂的用量与溶胀后的3D微胶囊的体积比为1-2:1-4。进本专利技术还提供了一种大规模干细胞培养设备，该设备包括生物反应器、中空纤维过滤器、控制装置和废液瓶，控制装置包括整合于一体的控制主机、磁悬浮离心进样泵、滤液/补液辅助泵组成，中空纤维过滤器用于将废液滤除，将细胞截留在生物反应器中，生物反应器通过第一连接管分别连接有细胞容纳瓶、培养基容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶和溶解剂容纳瓶，通过进样管路和回流管路与中控纤维过滤器相连接，中空纤维过滤器通过第二连接管与磁悬浮离心进样泵和滤液/补液辅助泵连接，磁悬浮离心进样泵通过废液管与废液瓶相连接。进一步地，中空纤维过滤器包括过滤器本体和设置于过滤器本体上的超声回流流量计，过滤器本体的底端分别通过磁悬浮泵泵头与进样压力传感器进样管路相连，靠近过滤器本体的回流管路上依次设有回流压力传感器和无菌取样断口，进样压力传感器和回流压力传感器与控制主机相连接。进一步地，与磁悬浮离心进样泵连接的第二连接管靠近过滤器本体的一端设有滤液压力传感器，滤液压力传感器与控制主机相连接。进一步地，生物反应器还连接有自动灌装机。本专利技术提供的大规模干细胞培养方法能够解决现有技术中大规模培养干细胞时难以收获的问题，且使用本专利技术提供的方法培养的干细胞增殖效果好、活率高，收获时间短。附图说明图1.为实施例1-3的大规模干细胞培养设备的结构示意图；其中，生物反应器1、控制装置2、废液瓶3、进样管路4、回流管路5、第二连接管6、废液管7、过滤器本体8、超声回流流量计9、磁悬浮泵泵头10与进样压力传感器11、进样压力传感器12和回流压力传感器13、滤液压力传感器14。具体实施方式实施例1本实施例提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法通过图1所示的设备实现；该培养方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5，微囊的孔径为10nm；将间充质干细胞接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1天，静态培养时的搅拌速度调至50RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为1vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；用3D微胶囊溶解剂进行解囊；收获扩增细胞；其中，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为30r/min；溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为100g/L，静置3h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1:2；3D微胶囊的制备方法为：S1：将重量百分比为1wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1wt％的明胶溶液以0.1:2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；S2：在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大规模干细胞培养方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：/n将3D微胶囊溶胀，所述3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5-10mm，所述微囊的孔径为10nm-10000nm；/n将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1-8×10

【技术特征摘要】
1.一种大规模干细胞培养方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：
将3D微胶囊溶胀，所述3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5-10mm，所述微囊的孔径为10nm-10000nm；
将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1-8×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1-3天，静态培养时的搅拌速度调至50-70RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37±1℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3-5天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为1-3vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞。


2.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为30-50r/min。


3.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，步骤(2)所述溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为100-1000g/L，静置3-5h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1-2:1-2。


4.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，所述3D微胶囊的制备方法为：
S1：将重量百分比为1-6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1-5wt％的明胶溶液以0.1-2:0.1-2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；
S2：在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶液中的浓度为5-100g/L，制得第二混合溶液；
S3：在所述第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，所述CaCl2溶液与所述第一混合溶液的体积比为1-2:1-2，制得3D微胶囊溶液；
S4：将所述3D微胶囊溶液用生理盐水洗涤3-6次，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹毓琳，贺伟，滕睿頔，王颖，张嗣良，张立新，白志惠，赵宇红，杨光，贾福强，
申请(专利权)人：北京唐颐惠康生物医学技术有限公司，北京臻溪谷医学研究中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：北京;11