一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高产2,5‑二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术应用基因工程方法，在一种高产L‑苏氨酸的大肠杆菌K‑12中过表达L‑苏氨酸脱氢酶TDH并异源表达来源于乳球菌属微生物的NADH氧化酶NoxE和来源于链球菌属微生物的氨基丙酮氧化酶AAO

【技术实现步骤摘要】
一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法
本专利技术涉及一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程

技术介绍
2,5-二甲基吡嗪，呈刺鼻的炒花生香气和巧克力、奶油气味，是一种重要的香味化合物和药物中间体。其存在于咖啡、花生等50多种天然食品中。作为食品香料时，只添加1-2ppm，就可起到明显的增香作用，是国标GB2760-86规定为允许使用的香精。同时，其还是合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪、新一代长效降血脂药阿昔莫司(Acipimox)以及治疗结核病的有效药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯(PAE)等一系列药物的原料或药物中间体。因此，摸索新的2,5-二甲基吡嗪经济高效的生产方法无疑是非常重要的。2,5-二甲基吡嗪的生产方法主要有化学合成法，添加前体物质发酵法，直接发酵法等。原本由于2,5-二甲基吡嗪的生物合成机制未完全明晰，难以通过人工定向手段选育可用于大规模生产的高产菌株，使得目前化学合成法仍是2,5-二甲基吡嗪的主要生产方法。但近年来，随着其在部分微生物中代谢途径的完全解析，人工定向选育2,5-二甲基吡嗪高产菌株已成为可能。加之生物发酵法相对于化学合成法有着反应条件温和，环境友好等优点，其已成为替代2,5-二甲基吡嗪化学合成生产方法的候补选项。而在已有文献报道的生物发酵法中，多为在液体或固体培养基中添加前体物质L-苏氨酸进行发酵的生物转化法，未见以廉价碳源为底物的直接发酵法，不仅成本高，而且转化率低。近年来的文献报道明确揭示出了2,5-二甲基吡嗪在枯草芽孢杆菌中的合成机制：代谢途径从L-苏氨酸开始，经L-苏氨酸脱氢酶TDH催化生成L-2氨基乙酰乙酸；再经自发脱羧反应，形成相对稳定的α-氨基丙酮；每两个α-氨基丙酮再经过脱水缩合成环状的3,6-二氢-2,5-二甲基吡嗪，进而被氧化脱氢，生成2,5-二甲基吡嗪。其中，L-苏氨酸脱氢酶TDH是整个生化反应的关键限速酶，之后的反应都是可自发完成的。因而筛选一种高活性的L-苏氨酸脱氢酶对于2,5-二甲基吡嗪的生产极为重要。另外，α-氨基丙酮虽然会发生自发的关环反应，但过程中存在其他副反应，生成二级胺HN(CH2COCH3)2、三级胺N(CH2COCH3)3以及2,6-二甲基吡嗪等副产物，影响下游分离和产品纯度。除了主代谢通路，2,5-二甲基吡嗪代谢途径中还存在着其他支路。在大肠杆菌K-12中主要存在两条：(1)2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶KBL会催化L-2氨基乙酰乙酸向甘氨酸反应。(2)伯胺氧化酶会催化α-氨基丙酮脱氨向丙酮醛反应。两条支路的分流都会影响2,5-二甲基吡嗪的合成，降低产率和产量。另外辅因子循环也是影响2,5-二甲基吡嗪合成的关键因素之一。每合成1mol2,5-二甲基吡嗪，L-苏氨酸脱氢酶都会消耗2molNADP+/NAD+产生2molNADPH/NADH。NADP+/NAD+在2,5-二甲基吡嗪发酵过程中发挥多种生理功能，如调节胞内氧化还原水平，影响众多基因表达，细胞功能，代谢途径和物质跨膜运输等。所以NADP+/NAD+不仅要满足菌体的生长还要满足2,5-二甲基吡嗪合成需求。而胞内NADP+/NAD+供应与消耗的不平衡，将会影响2,5-二甲基吡嗪合成。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术以高产苏氨酸的大肠杆菌K-12为出发菌，通过构建L-苏氨酸脱氢酶种间进化树，挑选并检测不同种L-苏氨酸脱氢酶活性，筛选得更高活性的酶并在出发菌中表达，提高关键限速步骤的反应速率。其次异源表达了来源于乳球菌属微生物的NADH氧化酶，改善了重组菌中辅因子不平衡的缺点。接着，为减少副产物产量并加快α-氨基丙酮正确闭环反应，异源表达了来源于链球菌属微生物的氨基丙酮氧化酶。同时，敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA以聚拢碳流。最终，获得了高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌株。首次实现了以葡萄糖为底物直接发酵生产2,5-二甲基吡嗪。本专利技术的第一个目的是提供一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌，所述的重组菌以大肠杆菌K-12为宿主，过表达了L-苏氨酸脱氢酶，并异源表达了NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶，同时敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA。进一步地，所述的大肠杆菌K-12包括E.coliTHR、E.coliTHR1、E.coliTHR2、E.coliTHR3、E.coliTHR4、E.coliTHR5或E.coliTHR6。其中，E.coliTHR、E.coliTHR1、E.coliTHR2、E.coliTHR3、E.coliTHR4、E.coliTHR5和E.coliTHR6记载在已发表的文献中，已发表的文献为《产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能》魏佳等，微生物学通报；并保藏于江南大学工业生物技术教育部重点实验室中。进一步地，所述的L-苏氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌K-12，为以下任一：(1)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的L-苏氨酸脱氢酶；(2)具有L-苏氨酸脱氢酶活性的同工酶。进一步地，所述NADH氧化酶来源于乳球菌属微生物，为以下任一：(1)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的NADH氧化酶；(2)具有NADH氧化酶活性的同工酶。进一步地，所述的氨基丙酮氧化酶来源于链球菌属微生物，为以下任一：(1)氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的氨基丙酮氧化酶；(2)具有氨基丙酮氧化酶活性的同工酶。进一步地，所述的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步地，所述的伯胺氧化酶基因tynA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。进一步地，所述的苏氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶是以pEC-XK99E质粒作为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供所述的重组菌的构建方法，包括如下步骤：(1)2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA的敲除：以大肠杆菌K-12为宿主，采用λ-red同源重组系统将基因kbl替换为两端带有FRT的标记基因后，利用FLP重组酶消除标记基因，再用同样的方法敲除基因tynA；(2)重组质粒构建：tdh基因、noxE基因和aaoso基因的前端分别加上SD结合序列TAAGGAGGAAAAAAAA，再依次酶切连接至质粒pEC-XK99E的启动子后得到重组质粒；(3)重组菌构建：将重组质粒导入敲除基因kbl和基因tynA的大肠杆菌宿主中，筛选得到所述的重组菌。本专利技术的第三个目的是提供所述的重组菌发酵生产2,5-二甲基吡嗪的方法，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，35～38℃，50～200r·min-1培养8-10h；以8～12％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35～38℃，50～200r·min-1培养至5～7h时加IPTG，再培养25～35h结束发酵。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌以大肠杆菌K-12为宿主，过表达了L-苏氨酸脱氢酶，并异源表达了NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶，同时敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌以大肠杆菌K-12为宿主，过表达了L-苏氨酸脱氢酶，并异源表达了NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶，同时敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl和伯胺氧化酶基因tynA。


2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的大肠杆菌K-12包括E.coliTHR、E.coliTHR1、E.coliTHR2、E.coliTHR3、E.coliTHR4、E.coliTHR5或E.coliTHR6。


3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的L-苏氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌K-12，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的L-苏氨酸脱氢酶；
(2)具有L-苏氨酸脱氢酶活性的同工酶。


4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述NADH氧化酶来源于乳球菌属微生物，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的NADH氧化酶；
(2)具有NADH氧化酶活性的同工酶。


5.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的氨基丙酮氧化酶来源于链球菌属微生物，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的氨基丙酮氧化酶；
(2)具有氨基丙酮氧化酶活性的同工酶。


6.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kbl的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


7.一种权利要求1～6任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)2-氨基-3-酮丁...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建中，于海波，张伟国，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32