一种原位荧光标记地杆菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种原位荧光标记地杆菌的方法，将PpFbFP荧光蛋白基因转入地杆菌，本发明专利技术的PpFbFP荧光蛋白标记不受氧气的影响，可以在厌氧条件下使得被标记的地杆菌菌株发荧光，且半衰期长，能够实现长期实时观察地杆菌的运动轨迹、成膜过程及群体行为。

【技术实现步骤摘要】
一种原位荧光标记地杆菌的方法
本专利技术涉及一种原位荧光标记地杆菌的方法，属于微生物

技术介绍
地杆菌(Geobacter)是自然环境中数量最多、分布最广的电活性细菌，也是研究最为广泛、电子转移活性最强的电活性模式菌株，广泛分布于淡水沉积物、有机物及重金属污染的地下水沉积层等厌氧环境，具有铁还原、腐殖质还原与产电三大功能。由地杆菌形成的电活性生物膜在环境修复及生物工程方面有重要的应用价值，可实现处理污染物的同时产出电能或其他化学制品，有助于污染修复技术向低投入、低能耗、低污染的方向转型。利用原位荧光蛋白标记技术，实时的探究地杆菌生物膜形成的动态过程及细菌间的群体行为，对促进地杆菌电活性生物膜的形成、提高其环境及经济效益具有重要的意义。目前，原位荧光蛋白标记的方法在研究基因的调控及蛋白的合成、折叠、定位、运动和相互作用等方面已经得到广泛的应用。其中，一种来自维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白(GFP)应用最广泛。然而，其发色光团的合成需要氧分子作为必须的辅因子，因此无法在厌氧菌地杆菌中应用。此外GFP的半衰期较短，这也使其在长期原位观察生物膜的形成过程中受到限制。因此，寻找一种能够在厌氧条件下发光且半衰期较长的荧光探针及其标记方法是解决当前地杆菌无法进行原位荧光标记的有效策略。
技术实现思路
本专利技术提供了一种原位荧光标记地杆菌的方法，可以有效解决上述问题。本专利技术是这样实现的：一种原位荧光标记地杆菌的方法，将PpFbFP荧光蛋白基因转入地杆菌。作为进一步改进的，所述PpFbFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO：01所示。作为进一步改进的，所述地杆菌为Geobactersulfurreducens菌。作为进一步改进的，包括以下步骤：S1，采用质粒pUC19构建含有PpFbFP荧光蛋白基因的质粒pUC-PpFbFP；S2，将步骤S1构建的质粒pUC-PpFbFP转入Geobactersulfurreducens菌。作为进一步改进的，所述质粒pUC-PpFbFP在构建时插入ompJ的强启动子。作为进一步改进的，所述质粒pUC-PpFbFP在构建时还插入庆大霉素抗性基因。作为进一步改进的，所述PpFbFP荧光蛋白基因插入质粒pUC19的位点GSU0808与GSU0807之间。作为进一步改进的，步骤S2具体为：A，使用限制性内切酶ScaI单酶切质粒pUC-PpFbFP使其线性化，并将线性化质粒进行浓缩；B，在厌氧条件下，将培养至对数期的GeobactersulfurreducensPCA4℃预冷后，离心并收集菌体，并用4℃预冷的电转Buffer洗涤菌体两次，制备GeobactersulfurreducensPCA感受态；C，取浓缩后的线性化质粒pUC-PpFbFP加入到GeobactersulfurreducensPCA感受态细胞悬浮液中，混匀后移入预冷的电击杯底部，进行瞬时电击，促进质粒转入感受态细胞中；D，用NBAF培养基悬浮转化后的GeobactersulfurreducensPCA电感受态细胞进行培养，取不同浓度的菌液涂布含有庆大霉素的NBAF琼脂平板，并将其置于厌氧培养箱中培养，挑取平板上的单菌落接种到NBAF培养基中，待菌株增殖生长后进行PCR扩增验证。作为进一步改进的，所述瞬时电击的参数为1.47Kv/cm，时间为5ms。作为进一步改进的，所述庆大霉素含量为10-30μg/mL。本专利技术还提供一种质粒pUC-PpFbFP的构建方法，包括以下步骤：(1)提取GeobactersulfurreducensPCA基因组DNA，并以GeobactersulfurreducensPCA基因组DNA为模板，以引物对GSU0808F/GSU0808R、PompJF/PompJR、GSU0807F/GSU0807R，利用PCR扩增技术分别扩增GSU0808、PompJ及GSU0807的核苷酸序列；采用质粒pCM351、引物对GentFor/GentRev，利用PCR技术扩增庆大霉素抗性基因Gent；(2)将扩增的GSU0808、PompJ、GSU0807核苷酸序列及基因Gent进行纯化；(3)将纯化的GSU0808、PompJ、GSU0807核苷酸序列及基因Gent与线性化的pUC19质粒载体进行Infusion构建质粒pUC-PpFbFP；(4)将重组质粒pUC-PpFbFP转入E.coliDH5α感受态细胞进行培养，挑取单菌落并进行测序验证。本专利技术还提供一种上述的方法构建的质粒pUC-PpFbFP。本专利技术的有益效果是：本专利技术的PpFbFP荧光蛋白标记不受氧气的影响，可以在厌氧条件下使得被标记的地杆菌发荧光，且半衰期长(>40h)，能够实现长期实时观察严格厌氧微生物地杆菌的运动轨迹、成膜过程及群体行为。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1是本专利技术实施例的质粒pUC-PpFbFP基因排布图。图2是本专利技术实施例的GeobactersulfurreducensPpFbFP荧光检测图。图3是本专利技术的实施例的PpFbFP荧光蛋白标记的GeobactersulfurreducensPpFbFP的PCR鉴定图。具体实施方式为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本专利技术的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本专利技术的范围，而是仅仅表示本专利技术的选定实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。在本专利技术的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本专利技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。实施例本实施例中所涉及的菌株：(1)Escherichiacoli菌株DH5α化学感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)用于基因克隆与质粒扩增。(2)GeobactersulfurreducensPCA(购自美国典型培养物保藏中心，菌株编号ATCC-5157本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：将PpFbFP荧光蛋白基因转入地杆菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：将PpFbFP荧光蛋白基因转入地杆菌。


2.根据权利要求1所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：所述PpFbFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO：01所示。


3.根据权利要求1所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：所述地杆菌为Geobactersulfurreducens菌。


4.根据权利要求3所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，采用质粒pUC19构建含有PpFbFP荧光蛋白基因的质粒pUC-PpFbFP；
S2，将步骤S1构建的质粒pUC-PpFbFP转入Geobactersulfurreducens菌。


5.根据权利要求4所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：所述质粒pUC-PpFbFP在构建时插入ompJ的强启动子。


6.根据权利要求4所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：所述质粒pUC-PpFbFP在构建时还插入庆大霉素抗性基因。


7.根据权利要求4所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：所述PpFbFP荧光蛋白基因插入质粒pUC19的位点GSU0808与GSU0807之间。


8.根据权利要求4所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：步骤S2具体为：
A，使用限制性内切酶ScaI单酶切质粒pUC-PpFbFPFP使其线性化，并将线性化质粒进行浓缩；
B，在厌氧条件下，将培养至对数期的GeobactersulfurreducensPCA4℃预冷后，离心并收集菌体，并用4℃预冷的电转Buffer洗涤菌体两次，制备Geob...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘星，靖宪月，高鹏宇，刘璐，周顺桂，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35