产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于合成生物学领域，涉及一种产长叶烯的基因工程菌。该基因工程菌为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因(包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和长叶烯合成酶基因lgfS)的重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经过优化内源MEP合成途径的底盘改造和并通过引入异源MVA途径中关键酶基因优化代谢途径，所获得的产长叶烯的基因工程菌具有较高的长叶烯产量。将该基因工程接入发酵培养基，加入诱导剂IPTG，并在发酵培养过程中加入长链正构烷烃进行双相萃取发酵，长叶烯摇瓶产量达到1.77mg/L，具有较好的工业运用前景。

【技术实现步骤摘要】
产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于合成生物学领域，涉及产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
异戊二烯类化合物，也称萜烯或萜类化合物，是一类自然界中广泛存在的种类最多的化合物，已有40000多种不同的萜类化合物从植物、动物及微生物中分离出来。这类化合物丰富多样的结构为解决人类健康和社会问题提供了良好的化合物筛选库，并且一些化合物已广泛用于医药、保健食品、香料、农用化学品等。然而，这类化合物在天然宿主中的产量极少，很大程度上限制了这类化合物的工业生产及应用。目前解决该困难的有效方法之一，是通过合成生物学及途径工程手段对异源微生物或植物的代谢途径进行重组改造，引入目标产物合成的关键基因，通过途径优化等策略异源合成目标产物。该生物方法具有生产工艺简单、周期短、对环境友好、不依赖于土地及气候因素的优点。目前已有很多成功的实例，其中最具有代表性的当属青蒿素前体青蒿酸、紫杉醇前体紫杉二烯和番茄红素。长叶烯是从属倍半萜烯类的一种有广阔市场价值的重要平台化学品，具有特殊的化学活性，由于其具有特殊的木香气味广泛用于合成长叶烯酯、长叶烷醇、异长叶烯、异长叶烯酮等香料产品，同时也是食品和化妆品的重要原料。另外它还具有高的水解稳定性，高的体积电阻率以及合适的粘度和闪点，可用作润滑油和驱虫剂的添加材料。长叶烯具备0.928g/mL的高密度及燃烧热，基于长叶烯的燃料比常规的海军喷气燃料的体积净燃烧热高出17％，其加氢产物可作为高密度燃料的原料。一直以来，长叶烯的制备多从天然松木树脂中提取或者利用有机试剂通过一系列化学合成而得。但植物提取方法存在产率低、成本高以及资源有限等不可避免的限制因素，且因长叶烯复杂的环状骨架，化学方法能耗大、工序复杂，因此微生物发酵合成长叶烯的方法成为一种绿色、可持续、反应条件温和的有吸引力的替代方法。大肠杆菌因其遗传背景清晰、操作简便等优势成为首选宿主。长叶烯属于萜烯类化合物，该类物质在生物体内可由两条天然代谢途径生成，分别是存在于真核细菌、古细菌、高等植物细胞液中的甲羟戊酸途径(MVA)，以及存在于植物质体、细菌和藻类的非甲羟戊酸途径(MEP)。基于上述两条代谢途径合成的相同C5前体物二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)，进而在系列合酶即香叶酯二磷酸合酶、法尼基焦磷酸合酶及长叶烯合酶的催化作用下可生成目的产物长叶烯。但是，目前针对生物法合成长叶烯的报道较少，且未能实现工业化生产。因此，目前存在的问题是需要构建一种产长叶烯的基因工程菌以及利用该基因工程菌生产长叶烯的方法，利用该基因工程菌生产长叶烯，产量高、效率高、成本低、绿色环保，且易于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种产长叶烯的基因工程菌，该基因工程菌高产长叶烯，且易于工业化生产。本专利技术的目标之二在于提供一种上述产长叶烯的基因工程菌的构建方法，该方法能够克服天然植物提取方法产量低、效率低、成本高以及植物生长受限等弊端，还有克服化学合成法成本高、污染大的不足。本专利技术的目的之三在于提供上述基因工程菌在生产长叶烯中的应用，对该基因工程菌进行发酵培养生产长叶烯，产量高、效率高、成本低、绿色环保，且易于工业化生产。为此，本专利技术首先提供了一种产长叶烯的基因工程菌。根据本专利技术第一方面的一些实施方式，所述产长叶烯的基因工程菌为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的重组大肠杆菌。本专利技术中，所述长叶烯合成的相关基因包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和长叶烯合成酶基因lgfS。在本专利技术的一些实施例中，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA为来源于大肠杆菌JM109的内源性基因，并且其在重组大肠杆菌中过表达。在本专利技术的一些优选的实施例中，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA以大肠杆菌JM109基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的另一些实施例中，长叶烯合成酶基因lgfS为来源于挪威云杉且经密码子优化的长叶烯合成酶基因lgfS，并且其在重组大肠杆菌中过表达。在本专利技术的一些优选的实施例中，所述长叶烯合成酶基因lgfS基因的序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术第二方面的一些实施方式，所述产长叶烯的基因工程菌为经过底盘改造的重组大肠杆菌。根据本专利技术，所述底盘改造包括优化内源MEP合成途径，其包括在重组大肠杆菌中过表达内源MEP合成途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，以及在重组大肠杆菌中过表达来源于肺炎链球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi。在本专利技术的一些实施例中，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.13所示。在本专利技术的另一些实施例中，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.14所示。在本专利技术的又一些实施例中，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi以肺炎链球菌基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.4所示。根据本专利技术第三方面的一些实施方式，所述基因工程菌为经过代谢途径优化的重组大肠杆菌。根据本专利技术，所述代谢途径优化包括在重组大肠杆菌中过表达异源MVA途径的上游关键酶基因，以及在重组大肠杆菌中表达异源MVA途径的下游关键酶基因。本专利技术中，所述异源MVA途径的上游关键酶基因包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS。在本专利技术的一些实施例中，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS均来源于粪肠球菌。在本专利技术的一些具体的实施例中，乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE的序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的另一些具体的实施例中，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术中，所述异源MVA途径的下游关键酶基因包括甲羟戊酸激酶基因mvk、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD。在本专利技术的一些实施例中，所述甲羟戊酸激酶基因mvk来源于马氏八叠球菌，其序列如SEQIDNO.7所示。在本专利技术的另一些实施例中，所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD均来源于肺炎链球菌。在本专利技术的一些具体的实施例中，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk的序列如SEQIDNO.8所示。在本专利技术的另一些具体的实施例中，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD的序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术一些具体优选的实施例中，所述基因工程菌为含有质粒pfdiAES(prsf-lgfs-idi-ispA-mvaE-mvaS)、质粒pAdxsr(pACYC-dxs-dxr)和质粒pTmpkD(pTrc99a-mvk-pmk-mvaD)的重组大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产长叶烯的基因工程菌，其为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的重组大肠杆菌；优选地，所述长叶烯合成的相关基因包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和长叶烯合成酶基因lgfS。/n

【技术特征摘要】
1.一种产长叶烯的基因工程菌，其为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的重组大肠杆菌；优选地，所述长叶烯合成的相关基因包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和长叶烯合成酶基因lgfS。


2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA为来源于大肠杆菌JM109的内源性基因，并且其在重组大肠杆菌中过表达；优选地，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA以大肠杆菌JM109基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.2所示；和/或，所述长叶烯合成酶基因lgfS为来源于挪威云杉且经密码子优化的长叶烯合成酶基因lgfS，并且其在重组大肠杆菌中过表达；优选地，所述长叶烯合成酶基因lgfS基因的序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产长叶烯的基因工程菌为经过底盘改造的重组大肠杆菌；优选地，所述底盘改造包括优化内源MEP合成途径，其包括在重组大肠杆菌中过表达内源MEP合成途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，以及在重组大肠杆菌中过表达来源于肺炎链球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi。


4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.13所示；和/或，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.14所示；和/或，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi以肺炎链球菌基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.4所示。


5.根据权利要求1-4中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过代谢途径优化的重组大肠杆菌；所述代谢途径优化包括在重组大肠杆菌中过表达异源MVA途径的上游关键酶基因，以及在重组大肠杆菌中表达异源MVA途径的下游关键酶基因；优选地，所述异源MVA途径的上游关键酶基因包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS；和/或，所述异源MVA途径的下游关键酶基因包括甲羟戊酸激酶基因mvk、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD。


6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳辉，魏丽娟，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11