一种利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法，步骤包括(1)构建用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状RNA支架；(2)构建三角形网状RNA支架中锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组质粒；(3)构建利用三角形网状RNA支架固定重组酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌；(4)利用步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌发酵生产阿洛醇。本发明专利技术利用RNA支架锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶，缩短酶促反应的距离，高效促进了阿洛醇合成。实验证实本发明专利技术方法构建的工程菌阿洛醇的产量能从3.036g/L提高到4.433g/L，有望在工业实际应用中，最大化地提高产物的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法
本专利技术涉及一种利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇(蒜糖醇)生产的方法。属于生物化工领域。
技术介绍
阿洛醇(蒜糖醇)是一种六碳的稀有糖醇，可在食品工业中用作无能量甜味剂或膨体剂，是治疗糖尿病、癌症和艾滋病的医药中间体，也是治疗便秘的药物。它还可以作为底物生产其他类型的D或L型稀有糖，如D/L-阿拉伯糖和D/L-阿洛糖。阿洛醇在自然界中含量极低。因此，从自然资源中提取没有经济效益，并且会对环境造成严重破坏。化学合成阿洛醇工艺复杂，产率低，会产生有毒性的副产物。相比之下，生物转化是生产阿洛醇的理想方法。在细胞中，对于天然的多酶反应途径，酶分子通常在物理和空间上组织成支架或簇或微腔。空间组织有助于底物在相互作用蛋白之间的流动，限制了不同中间代谢物之间的串扰，增加酶分子周围底物的浓度，加速了反应过程。但是，对于大多数表达多酶催化反应的重组菌株，表达的酶分子会在细胞内随机分布，造成不利影响。申请人研究发现在细胞内设置二维的三角形网状RNA支架有助于使重组酶分子锚定到支架相邻位置，克服上述不利影响，有望在发酵生产中得到应用。检索显示，有关利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇(蒜糖醇)生产的方法还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇(蒜糖醇)生产的方法。本专利技术所述的利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法，步骤是：(1)构建用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状RNA支架；合成一段如SEQIDNo.6所示的DNA序列，利用引物1和2将质粒pET22b线性化，根据同源重组构建重组质粒pET22b-scaffold；将同源重组液转化到DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR验证获得阳性转化子，再提取重组质粒pET22b-scaffold，通过重组质粒转化到大肠杆菌中实现支架的构建；其中，所述引物1和2如下：引物1：5’>CCCTATAGTGAGTCGTATTAACCTAATGCAGGTCCCGGAAGA<3’，下划线序列为与pET22b质粒重叠序列；引物2：5’>CCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCGTAATgctcgccacttcgggctcatgagcg<3’，下划线序列为与pET22b质粒重叠序列；(2)构建三角形网状RNA支架锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组质粒；从Genebank基因库中查询获得的核糖醇脱氢酶基因片段和甲酸脱氢酶基因片段，利用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，确定SEQIDNo.4所示的PP7的适配体序列和SEQIDNo.5所示的BIV-TAT的适配体序列，将BIV-Tat标记FDH，将PP7标记RDH，利用引物5和6合成pp7-rdh和biv-tat-fdh基因，利用引物7，引物8通过PCR扩增得到核糖醇脱氢酶基因序列，利用引物9，引物10通过PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因序列，同时利用引物3和4将pACYCDuet1质粒进行线性化，并将线性化的pACYCDuet1质粒与合成得到的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因进行同源重组，通过菌落PCR验证获得将目标基因亚克隆到质粒pACYCDuet1中的重组菌株，对获得阳性转化子提取质粒，所获得的重组质粒命名为pACYCDuet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh；将此构建的重组质粒转化到大肠杆菌BLStar细胞中，并通过IPTG诱导两种酶融合体的表达，确认重组质粒的正确性；其中，所述涉及的引物序列如下：引物3：5’>ttaacctaggctgctgccac<3’，下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列；引物4：5’>TCCTGATCCTTTTTCGAACTGC<3’，下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列；引物5：5’>cagcggtggcagcagcctaggttaattaCACGGCTTTTTTGAATTTTG<3’下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列。引物6：5’>AGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGGATCAGGAATGTCCAAAACCATCGTTCTTTCGGT<3’下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列；引物7：5’>GGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGgaATGGCCATTAGCCTGGAAAATAAGG<3’下划线序列为与核糖醇脱氢酶基因重叠序列；引物8：5’>tttcgattatgcggccgtgtacaatacgaTTACAGATCAACACTATTCGGCAGAAT<3’下划线序列为与核糖醇脱氢酶基因重叠序列；引物9：5’>GTcatcaccatcatcaccacGGATCAGGAATGGCAAAAGTGCTGTGCGTGCTGT<3’下划线序列为与甲酸脱氢酶基因重叠序列；引物10：5’>ttgctcagcggtggcagcagcctaggttaattaCACGGCTTTTTTGAATTTTG<3’下划线序列为与甲酸脱氢酶基因重叠序列；(3)构建利用三角形网状RNA支架固定重组酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌；将重组质粒pACYCDuet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh及pET22b-scaffold共同转化到大肠杆菌BLStar中构建工程菌株，并进行鉴定验证即获得利用三角形网状RNA支架固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌，该工程菌包含大肠杆菌BLStar的全基因组，重组质粒pET22b-scaffold和重组质粒pACYCDuet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh；(4)利用步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌发酵生产阿洛醇；活化步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌菌种，按体积比1～2％的量将活化后的菌种接种到每100mL的发酵培养基中，先以37℃和200rpm培养，培养3h后，当培养菌液的OD为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，并将发酵条件改变为28℃和140rpm，继续培养6～9h；然后将培养的菌液进行收菌，采用全细胞转化法，将D-阿洛酮糖转化为阿洛醇，通过标准曲线确定阿洛醇的产量并验证大肠杆菌工程菌内已将核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶锚定在RNA支架上；其中，所述发酵培养基的配方是：每100mL的发酵培养基中，含1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1gNaCl、0.5g葡萄糖、终浓度为100μg/mL的氯霉素和氨苄青霉素、20mM的MgCl2。上述利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法中：所述用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状RNA支架是由二维的三角形网状RNA支架与SEQIDNo.4所示的PP7的适配体序列和SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法，步骤是：/n(1)构建用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状RNA支架；/n合成一段如SEQ ID No.6所示的DNA序列，利用引物1和2将质粒pET22b线性化，根据同源重组构建重组质粒pET22b-scaffold；将同源重组液转化到DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR验证获得阳性转化子，再提取重组质粒pET22b-scaffold，通过重组质粒转化到大肠杆菌中实现支架的构建；其中，所述引物1和2如下：/n引物1：5’>CCCTATAGTGAGTCGTATT

【技术特征摘要】
1.一种利用重组胞内RNA支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法，步骤是：
(1)构建用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状RNA支架；
合成一段如SEQIDNo.6所示的DNA序列，利用引物1和2将质粒pET22b线性化，根据同源重组构建重组质粒pET22b-scaffold；将同源重组液转化到DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR验证获得阳性转化子，再提取重组质粒pET22b-scaffold，通过重组质粒转化到大肠杆菌中实现支架的构建；其中，所述引物1和2如下：
引物1：5’>CCCTATAGTGAGTCGTATTAACCTAATGCAGGTCCCGGAAGA<3’，下划线序列为与pET22b质粒重叠序列；
引物2：5’>CCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCGTAATgctcgccacttcgggctcatgagcg<3’，下划线序列为与pET22b质粒重叠序列；
(2)构建三角形网状RNA支架锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组质粒；
从Genebank基因库中查询获得的核糖醇脱氢酶基因片段和甲酸脱氢酶基因片段，利用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，确定SEQIDNo.4所示的PP7的适配体序列和SEQIDNo.5所示的BIV-TAT的适配体序列，将BIV-Tat标记FDH，将PP7标记RDH，利用引物5和6合成pp7-rdh和biv-tat-fdh基因，利用引物7，引物8通过PCR扩增得到核糖醇脱氢酶基因序列，利用引物9，引物10通过PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因序列，同时利用引物3和4将pACYCDuet1质粒进行线性化，并将线性化的pACYCDuet1质粒与合成得到的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因进行同源重组，通过菌落PCR验证获得将目标基因亚克隆到质粒pACYCDuet1中的重组菌株，对获得阳性转化子提取质粒，所获得的重组质粒命名为pACYCDuet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh；将此构建的重组质粒转化到大肠杆菌BLStar细胞中，并通过IPTG诱导两种酶融合体的表达，确认重组质粒的正确性；其中，所述涉及的引物序列如下：
引物3：5’>ttaacctaggctgctgccac<3’，下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列；
引物4：5’>TCCTGATCCTTTTTCGAACTGC<3’，下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列；
引物5：5’>cagcggtggcagcagcctaggttaattaCACGGCTTTTTTGAATTTTG<3’下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列。
引物6：5’>AGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGGATCAGGAATGTCCAAAACCATCGTTCTTTCGGT<3’下划线序列为与pACYCDuet1质粒重叠序列；
引物7：5’>GGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGgaATGGCCATTAGCCTGGAAAATAAGG<3’下划线序列为与核糖醇脱氢酶基因重叠序列；
引物8：5’>tttcgattatgcggccgtgtacaatacgaTTACAGATCAACACTATTCGGCAGAAT<3’下划线序列为与核糖醇脱氢酶基因重叠序列；
引物9：5’>GTcatcaccatcatcaccacGGATCAGGAATGGCAAAAGTGCTGTGCGTGCTGT<3’下划线序列为与甲酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建强，柴玉颖，温鑫，任一林，孙煦茵，宋欣，林建群，
申请(专利权)人：山东大学，青岛龙鼎生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37