一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种谷氨酸脱羧酶重组菌，该重组菌为导入了谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌，其中所述的谷氨酸脱羧酶基因为来源于弓形链霉菌NRRL 15443的StGAD、链霉菌MJ654‑NF4的SsGAD或嗜铬链霉菌ATCC 49982的ScGAD，其核苷酸序列如SEQ ID No：1‑3所示。本发明专利技术采用弓形链霉菌NRRL 15443、链霉菌MJ654‑NF4和嗜铬链霉菌ATCC 49982作为菌株，通过PCR扩增技术从上述三种菌株的基因组上扩增得到了谷氨酸脱羧酶的编码基因：SsGAD、StGAD、ScGAD，利用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为宿主，成功构建了能够高效表达谷氨酸脱羧酶的重组菌，该工程菌经历至少10次的重复利用依然保持极高的转化效率。本发明专利技术还提供了上述重组菌的构建方法及该重组菌在制备GABA的应用，上述方法生产易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用。
技术介绍
目前，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，简称GABA)是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有调节血压、促进精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢、改善更年期综合征等多种功效。γ-氨基丁酸正被广泛应用于医药、食品保健、化工及农业等行业。GABA的生产可以通过化学合成和生物合成。由于化学合成反应条件剧烈，化学原料和溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，缺乏安全性，主要应用于化工行业，不适宜作为食品添加剂和医药。生物合成条件温和，专一性强、副产物少、安全性高，因此以生物合成法生产食品或者医药级的GABA是一条较为理想的途径。谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase，GAD)是生物体内催化谷氨酸发生α-脱羧生成GABA的唯一的酶。目前已经在多种微生物中发现GAD的存在，利用微生物中的GAD催化谷氨酸生产γ-氨基丁酸不受资源本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，该重组菌为导入了谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌，其中所述的谷氨酸脱羧酶基因为来源于弓形链霉菌NRRL 15443的StGAD、链霉菌MJ654-NF4的SsGAD或嗜铬链霉菌ATCC 49982的ScGAD，其核苷酸序列如SEQ ID No：1-3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，该重组菌为导入了谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌，其中所述的谷氨酸脱羧酶基因为来源于弓形链霉菌NRRL15443的StGAD、链霉菌MJ654-NF4的SsGAD或嗜铬链霉菌ATCC49982的ScGAD，其核苷酸序列如SEQIDNo：1-3所示。


2.一种如权利要求1所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建质粒：分别将SsGAD、StGAD、ScGAD进行PCR扩增，以pJET1.2作为基因克隆载体，将PCR扩增后的基因序列连接在其上，采用限制性内切酶针对酶切位点NdeI和HindIII进行酶切处理，分别将SsGAD结合物、StGAD结合物、ScGAD结合物连接到相应制粒上；(2)构建重组菌：分别将上述步骤(1)中的目标质粒导入相应菌种中即得所述重组菌。


3.根据权利要求2所述所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)的制粒为大肠表达质粒pET-28a(+)，分别得到目标制粒pHY6、pHW4、pHY1；上述步骤(2)将目标制粒pHY6、pHW4、pHY1导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中即的所述重组菌。


4.根据权利要求2所述所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中PCR扩增中SsGAD基因的引物序列为：
5′-AACATATGGCCTTGTACAAGGGCACCG
3′-AAAAGCTTTTAGTGGTGGAAGCCGGCGCGGACC；
StGAD基因的引物序列为：
5′-AACATATGGCTCTCCACAAGACGAAGGA
3′-AAAAGCTTTTAGTGGTGGAAGCCGGAGCGGGGA；
ScGAD基因的引物序列为：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：占纪勋，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33