一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2‑羟基丙酰‑CoA合成途径中相关基因以增加LA‑CoA的合成，改造途径还包括削弱大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI和yciA中的一种或两种，以减少LA‑CoA流向乳酸合成途径。本发明专利技术将大肠杆菌体内的LA‑CoA有效的流向目标产物的合成模块，减少目标产物合成前体LA‑CoA的浪费，通过对代谢途径的分析和调控，利用基因工程手段对大肠杆菌进行改造，获得的重组菌株产生的聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量明显增加。

【技术实现步骤摘要】
一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用
本专利技术属于生物工程
，更具体地讲，涉及利用葡萄糖或木糖生产聚羟基丁酸乳酸酯的基因工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用。
技术介绍
目前，常用的塑料大多是由石油和天然气等化石燃料合成的，导致了全球变暖及固体废弃物积累等环境问题，这些问题催促我们开发利用可持续的原料生产生物基聚合物。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是由微生物产生的一种聚酯，目前因其生物可降解性、光学性能和生物相容性等优良性质引起了研究者的广泛关注。聚乳酸是一种很有前景的生物质衍生聚合物，因为它可以替代石油基塑料，具有几种理想的性质，如生物降解性，生物相容性和可堆肥性，聚乳酸本身无毒，但是传统生化方法生产中的金属催化剂残留会影响其在医学等方面的应用。可惜目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，无法实现在生物体内一步生产。SeiichiTaguchi等利用底物相似性原则，通过对PHA合成酶进行突变成功地创造了微生物生物合成乳酸基聚酯的体系——聚3羟基丁酸乳酸酯P(3HB-co-LA)。P(3HB-co-LA)是PHA家族的一种，该聚合物融合了单独的聚乳酸透明且坚硬以及聚3-羟基丁酸不透明且易碎的特点，根据乳酸含量从而表现出不同的弹性和透明度。P(3HB-co-LA)由经过突变的具有乳酸聚合活性的PHA合成酶催化3-羟基丁酰辅酶A(3HB-CoA)和2-羟基丙酰-CoA(乳酰辅酶A，LA-CoA)合成。为了进一步提高乳酸组分含量，研究者尝试经过厌氧发酵使前体物质乳酸积累量增加，结果聚合物中乳酸的摩尔比大幅度增加到47mol％，但由于厌氧状态对于细胞生长有一定的阻碍作用，使得聚合物干重有所下降，仅占菌体的2wt％。Nduko等尝试对碳源优化，以木糖作为碳源时，在改造后的大肠杆菌细胞合成的聚合物中，乳酸组分达到34mol％，相比于在葡萄糖中的26mol％有了较大幅度提升，当对PHA合成酶进一步优化后，乳酸组分再次提高到60mol％。日本科学家SeiichiTaguchi发现，在大肠杆菌中引入突变的PHA合成酶、丙酸辅酶A转移酶、β酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶合成的P(3HB-co-LA)中，乳酸组分含量都在70％以下，而同一套体系在谷氨酸棒杆菌中表达，产生的P(3HB-co-LA)中，乳酸组分含量在96.8-99.3％，进一步研究发现，谷氨酸棒杆菌体内的LA-CoA处于较高水平，几乎和乙酰CoA同等浓度，但大肠杆菌体外的LA-CoA几乎检测不到。说明存在对LA-CoA有活性的降解酶，导致了LA-CoA的降解，缺失这种降解酶将对提高P(3HB-co-LA)中的乳酸组分含量具有重要意义。但目前在大肠杆菌中，关于降解LA-CoA的酶没有被报道。硫酯酶能水解化合物中羰基和硫原子之间的硫酯键的一大类酶，可以通过裂解酰基CoA中间体中硫酯键形成游离的羧酸和CoA，由Tillander等科学家首次在大肠杆菌中检测到。中国专利CN110295188A公开了一种提高大肠杆菌合成的聚(3-羟基丁酸-co-乳酸)中乳酸组分含量的方法，以E.coliMG1655为宿主，以启动子trc控制phaA、phaB、phaCm基因的重组表达，以阿拉伯糖启动子控制pctcp基因的重组表达构建获得重组大肠杆菌E.coliMG-01，在此基础上敲除黄素异戊烯基转移酶基因ubiX，和/或敲除D-乳酸脱氢酶基因dld，和/或替换表达丙酰辅酶A转移酶pctcp的启动子为组成型的ldhA启动子，并没有从降解LA-CoA的酶的途径进行改造。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法。本专利技术的第二个目的在于提供利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌菌株。本专利技术的第三个目的在于提供利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌在以葡萄糖或木糖为碳源发酵生产高乳酸组分的聚羟基丁酸乳酸酯中的应用。为了实现上述第一个目的，本专利技术提供了一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2-羟基丙酰-CoA(LA-CoA)合成途径中相关基因以增加LA-CoA的合成，所述相关基因包括phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且削弱大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI和yciA中的一种或两种，以减少LA-CoA流向乳酸合成途径。所述2-羟基丙酰-CoA(LA-CoA)合成途径中相关基因涉及4个酶，分别为β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、丙酸辅酶A转移酶突变体和PHA合成酶突变体。在罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)中，编码β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因分别是phaA和phaB；在荧光假单胞菌2P24(Pseudomonasfluorescensstrain2P24)中，编码PHA合成酶的基因是phaC，经过突变后基因是phaCm；在丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)中，编码丙酸辅酶A转移酶的基因是pct，经过突变后是pctcp。作为一个优选方案，同时过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp。具体地，phaA、phaB来源于Ralstoniaeutropha，phaCm来源于Pseudomonasfluorescensstrain2P24，pctcp来源于Clostridiumpropionicum。作为一个优选方案，改造途径还包括缺失dld。作为一个优选方案，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失ydiI。作为一个优选方案，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失yciA。作为一个优选方案，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失yciA和缺失ydiI。作为一个优选方案，改造途径为同时过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp，并且缺失dld，缺失yciA和缺失ydiI。为实现本专利技术第二个目的，本专利技术公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌菌株。为实现本专利技术第三个目的，本专利技术公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌菌株在以葡萄糖或木糖为碳源发酵生产高乳酸组分的聚羟基丁酸乳酸酯中的应用。以葡萄糖或木糖为主要碳源，在大肠杆菌常用的发酵培养基M9中发酵生产高乳酸组分的P(3HB-co-LA)。phaCm基因为Pseudomonasfluorescensstrain2P24来源的PHA合成酶突变体，其氨基酸序列在中国专利CN110295188A公开。在本专利技术的一种实施方式中，通过pTrc99a质粒表达phaA、phaB、phaCm。编码丙酸辅酶A转移酶的基因是pct，经过突变后是pctcp。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2-羟基丙酰-CoA合成途径中相关基因以增加LA-CoA的合成，所述相关基因包括phaA、phaB、phaCm和pct

【技术特征摘要】
1.一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2-羟基丙酰-CoA合成途径中相关基因以增加LA-CoA的合成，所述相关基因包括phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且削弱大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI和yciA中的一种或两种，以减少LA-CoA流向乳酸合成途径。


2.根据权利要求1所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，同时过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp。


3.根据权利要求1所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，还包括缺失dld。


4.根据权利要求3所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失ydiI...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴辉，魏香菊，吴榉，郭鹏业，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31