一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[制造技术

本申请公开了一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[

【技术实现步骤摘要】
一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[14/15N]-L-瓜氨酸的方法
本申请涉及一种生物催化制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，属于生物制药和生物化工

技术介绍
瓜氨酸是一种α-氨基酸，因最先从西瓜中获取，而得名瓜氨酸。L-瓜氨酸能提高体内一氧化氮的含量，一氧化氮可舒缓动脉，促进全身血液流动从而更好的工作。瓜氨酸对防治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺肿胀、前列腺肥大等作用明显。最近研究表明，瓜氨酸在体内转化为人体必需氨基酸L-精氨酸。精氨酸缺乏可导致一系列的心血管疾病，包括高血压、动脉粥样硬化、心衰等。由于L-瓜氨酸作为合成L-精氨酸的前体，在许多组织中能转化成L-精氨酸，且在胃肠道和肝脏中不代谢，亦不诱导精氨酸酶活性升高，因此补充L-瓜氨酸能辅助治疗精氨酸缺乏引起的相关疾病。瓜氨酸有较强的抗氧化能力，能够清除自由基，可有效保护DNA免受氧化反应的侵害，可以作为抗衰老、提高免疫力的保健品，也可作为美容化妆品，具有护肤防皱祛斑之功效。服用瓜氨酸能有效的改善人体的抗疲劳能力，维护健康的心肺功能，提高脑力清晰度，降低压力和克服沮丧情绪，平衡血糖浓度，增强人体的肌肉强度，在运动保健方面具有良好的作用。目前，瓜氨酸常用的生产方法主要有化学合成法、提取法、发酵法、酶转化法等。化学法是在碱性条件下水解精氨酸获得瓜氨酸，存在工艺难以精确控制，产物属于非单一构型，含有D-瓜氨酸，影响质量，产生的废水影响环境。专利CN105483060中通过发酵法生产瓜氨酸，主要采用诱变选育的方法，存在生产菌株随机性大，很难得到高产菌种。天然产物中瓜氨酸含量较低，原料来源受限，生产规模小，工艺复杂，产率低。专利CN104805144采用酶转化法合成瓜氨酸，工艺简单。但是使用的菌种为大肠杆菌，存在革兰氏阴性菌共同的缺点就是含有内毒素，限制其在食品或化妆品中的应用。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。化学法包括结合法、交联法。化学法酶与载体之间结合紧密，不易脱落，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，活力损失较大。
技术实现思路
根据本申请的第一方面，提供了一种含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，所述基因工程菌中表达精氨酸脱亚胺酶。具体的，所述基因工程菌中，在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶，所述的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacteriumglutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCNo.19404。所述基因工程菌由以下步骤制备：(1)将cipA基因序列在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，得到基因序列为SEQIDNO.1的片段，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子pXMJ19-cipA；(2)将精氨酸脱亚胺酶arc基因序列在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，得到基因序列为SEQIDNO.2的片段，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子重组质粒pXMJ19-cipA-arc。根据本申请的第二方面，提供了本申请的第一方面所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌用于转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸的应用。根据本申请的第三方面，提供了一种cipA-arc融合蛋白，精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上，产生具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc即cipA-arc融合蛋白。可选地，所述cipA-arc融合蛋白由以下步骤制备：(1)制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞；(2)重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化谷氨酸棒杆菌感受态细胞；(3)基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞，经过超声破碎、离心后，所得的沉淀即为cipA-arc融合蛋白(即包涵体蛋白cipA-arc形式固定化)。可选地，所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞由如下方法制备：将谷氨酸棒杆菌ATCC13032在含LBG固体培养基中培养后，挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，经培养后按0.8-1.5％的接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，继续培养至OD600为0.8-1.0；将菌液经冰水混合物预冷、离心，吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，再次经离心、吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。作为优选方案中将谷氨酸棒杆菌ATCC13032划线于含LBG(LBG液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，葡萄糖5g，调节pH7.0-7.5，补足去离子水至1L；固体平板为LBG液体培养基+12-15g/L的琼脂粉)固体培养基的平板中，于培养箱培养，待菌体长出挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养12-24h；按1％接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养至OD600为0.9；将菌液置于冰水混合物中预冷15-20min，再于超净台中将预冷的菌液分装至灭菌的离心管中，4℃6000g离心30s，冰水放置2min；将离心管中的上清液吸出，向离心管中各加入预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮；悬浮液于4℃6000g离心30s，将离心管中的上清液吸出，向离心管中加入预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮。可选地，所述培养的温度均为30℃；所述培养时的转速均为200r/min。可选地，所述重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞由如下方法制备：取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却后，在相同温度条件下，以电击条件为电压1-5kV，电击1-10ms；再在室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中，经振荡培养后取所得液体涂布于含氯霉素抗性平板，挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切、PCR确认目的片段的插入，得到的重组菌接种。作为优选方案中，取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却10min；迅速加入冰冷的电击杯电击，电击条件为电压2-4kV，时间3-7ms；脉冲结束后尽快取出电击杯，室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中轻柔振荡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中，在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶，所述的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacterium glutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.19404。/n

【技术特征摘要】
20191106 CN 20191107837061.一种含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中，在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶，所述的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacteriumglutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCNo.19404。


2.根据权利要求1所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由以下方法构建：
(1)将cipA基因序列在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，得到基因序列为SEQIDNO.1的片段，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子表达载体pXMJ19-cipA；
(2)将精氨酸脱亚胺酶arc基因序列在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，得到基因序列为SEQIDNO.2的片段，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子pXMJ19-cipA-arc，即为含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌。


3.一种cipA-arc融合蛋白，其特征在于，精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上，产生具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc即cipA-arc融合蛋白，所述cipA-arc融合蛋白的制备包括以下步骤：
(1)制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(2)采用权利要求1所述的重组质粒阳性转化子pXMJ19-cipA-arc电击转化步骤(1)所述的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，得到重组菌；
(3)将步骤(2)所述得到的重组菌经基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞，经超声破碎、离心后，所得的沉淀即为cipA-arc融合蛋白。


4.根据权利要求3所述的cipA-arc融合蛋白，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞采用如下制备方法：
将谷氨酸棒杆菌ATC...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄钢，李斌，李玥，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31