一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术通过10个不同强度的启动子依次优化三条神经氨酸合成途径中关键酶UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖‑2‑差向异构酶、N‑乙酰氨基葡萄糖‑6‑磷酸异构酶，以及氨基葡萄糖‑6‑磷酸‑N‑乙酰基转移酶、N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶和N‑乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平，降低了酶的表达对细胞造成的蛋白合成压力，并进一步将三条神经氨酸整合到同一株枯草芽孢杆菌工程菌中，获得了N‑乙酰神经氨酸产量提高的枯草芽孢杆菌，其在摇瓶水平下的产量达到了10.4g/L，为进一步提高枯草芽孢杆菌NeuAc产量奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。
技术介绍
N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，导致成本较高。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过UDP-N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuC关键酶合成途径，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以多个启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6～15。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以多个启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQIDNO.6～15。


2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以SEQIDNO.6～8任一所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，或以SEQIDNO.11～15任一所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，或以SEQIDNO.6所示的启动子调控N-乙酰神经氨酸合酶的表达，或以SEQIDNO.11所示的启动子调控UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，或以SEQIDNO.6～8、12～14任一所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶的表达。


3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以SEQIDNO.6所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，并以SEQIDNO.15所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，并以SEQIDNO.6所示的启动子调控N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并以SEQIDNO.11所示的启动子调控UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，并以SEQIDNO.6所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，刘龙，张晓龙，堵国成，李江华，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32