本发明专利技术公开了一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术通过10个不同强度的启动子依次优化三条神经氨酸合成途径中关键酶UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖‑2‑差向异构酶、N‑乙酰氨基葡萄糖‑6‑磷酸异构酶，以及氨基葡萄糖‑6‑磷酸‑N‑乙酰基转移酶、N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶和N‑乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平，降低了酶的表达对细胞造成的蛋白合成压力，并进一步将三条神经氨酸整合到同一株枯草芽孢杆菌工程菌中，获得了N‑乙酰神经氨酸产量提高的枯草芽孢杆菌，其在摇瓶水平下的产量达到了10.4g/L，为进一步提高枯草芽孢杆菌NeuAc产量奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。
技术介绍
N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，导致成本较高。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过UDP-N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuC关键酶合成途径，N-乙酰氨基葡萄糖为前体的Age关键酶合成途径，以及N-乙酰氨基葡萄-6磷酸为前体的NanE关键酶合成途径，由于途径涉及较多外源酶蛋白，同时引入多个酶蛋白容易导致细胞压力，不利于细胞生长和产物合成，因此难以实现多途径复合的策略，这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。
技术实现思路
为实现三条途径在枯草芽孢杆菌中高效表达，且不造成细胞代谢压力，本专利技术通过筛选不同强度的启动子对关键代谢途径的基因表达水平进行合理调控，以提高神经氨酸的含量。本专利技术的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，利用启动子强化了UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)和N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQIDNO.6～15。在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)。在一种实施方式中，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。在一种实施方式中，采用SEQIDNO.6～8任一所示的启动子强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达。在一种实施方式中，采用SEQIDNO.11～15任一所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。在一种实施方式中，采用SEQIDNO.6所示的启动子强化N-乙酰神经氨酸合酶的表达。在一种实施方式中，采用SEQIDNO.11所示的启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达。在一种实施方式中，采用SEQIDNO.6～8或SEQIDNO.12～14任一所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶的表达。在一种实施方式中，采用SEQIDNO.6所示的启动子强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，并用SEQIDNO.15所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，并用SEQIDNO.6所示的启动子强化N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并用SEQIDNO.11所示的启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，并用SEQIDNO.6所示的启动子强化N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶的表达。本专利技术的第二个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量的方法，是向枯草芽孢杆菌中引入脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以不同强度的启动子分别强化NeuC和NeuB参与的由UDP-N-乙酰葡萄糖合成N-乙酰神经氨酸的途径，强化Gna1、Age和NeuB参与的由葡萄糖胺-6-磷酸合成N-乙酰神经氨酸的途径，以及Gna1、NanE和NeuB参与的由6-磷酸-N-乙酰甘露糖苷合成N-乙酰神经氨酸的途径。在一种实施方式中，所述方法通过多个启动子强化枯草芽孢杆菌UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶，以及氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平；所述启动子具有如SEQIDNO.6～15任一所示的核苷酸序列。在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BSGN6-comK，其构建方法公开于论文《Modularpathwayengineeringofkeycarbon-precursorsupply-pathwaysforimprovedN-acetylneuraminicacidproductioninBacillussubtilis》中。本专利技术的第三个目是提供一种生产N-乙酰神经氨酸的方法，是将上述任一所述的重组枯草芽孢杆菌在含唾液酸的环境中培养，以生产神经氨酸。在一种实施方式中，所述培养是在30～37℃培养16～72h。在一种实施方式中，将所述重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中，培养12～18h获得OD为6～10的种子液，再以按体积比计1～10％的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。在一种实施方式中，所述发酵是在含有葡萄糖60g/L，胰蛋白胨6g/L，酵母粉12g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钾12.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁3g/L的培养基中进行。本专利技术还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在制备含神经氨酸或其衍生产品中的应用。在一种实施方式中，所述应用是用于制备药物或保健品。在一种实施方式中，所述衍生产品包括但不限于抗病毒药物扎那米韦(Zanamivir)或奥司他韦(Oseltamivir)。有益效果：(1)本专利技术通过筛选不同来源的N-乙酰神经氨酸合酶，确定了在低表达水平下仍有较高催化活性的脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并将其整合于重组枯草芽孢杆菌基因组上；(2)本专利技术通过以10个不同强度启动子分别优化三条神经氨酸合成途径关键酶UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)，以及氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)、N-乙酰氨基葡萄糖异本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以多个启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6～15。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以多个启动子强化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQIDNO.6～15。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以SEQIDNO.6～8任一所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，或以SEQIDNO.11～15任一所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，或以SEQIDNO.6所示的启动子调控N-乙酰神经氨酸合酶的表达，或以SEQIDNO.11所示的启动子调控UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，或以SEQIDNO.6～8、12～14任一所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶的表达。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以SEQIDNO.6所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达，并以SEQIDNO.15所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，并以SEQIDNO.6所示的启动子调控N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并以SEQIDNO.11所示的启动子调控UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，并以SEQIDNO.6所示的启动子调控N-乙酰氨基葡萄...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，刘龙，张晓龙，堵国成，李江华，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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