一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株，该菌株为猪种布鲁氏菌S2 Omp16ΔOmp16，于2019年12月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019991。所述菌株为在条件性诱导外源Omp16表达的基础上缺失内源性Omp16基因的布鲁氏菌S2疫苗株，可用于制备布鲁氏菌减毒疫苗。布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株为探究Omp16对布鲁氏菌的致病机制及区分自然感染和人工免疫的特性奠定基础，对预防和控制布病具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用。
技术介绍
布鲁氏菌又称布鲁菌或布氏杆菌，属于革兰阴性胞内寄生菌，能够引起布鲁氏菌病，简称布病。布鲁氏菌主要感染反刍动物，如牛、羊和猪，但仍然可以感染野生动物和海洋动物，乃至人类。布鲁氏菌感染家畜主要症状为怀孕母畜的妊娠后期流产和公畜的睾丸炎。人类感染布鲁氏菌的主要症状与家畜不同，临床上主要表现为反复发热、无力、关节炎和睾丸炎等。布鲁氏菌在全球的不断肆虐，造成严重的经济损失。每年，全球约超过50万人感染布鲁氏菌病。此外，由于人类缺乏典型的临床症状，真实的每年新感染人数可能更高。人类感染布鲁氏菌病主要通过直接接触患病动物或食用受污染的奶制品，并且人类感染布鲁氏菌具有职业倾向性，如牧民和兽医为高风险感染人群。布鲁氏菌外膜蛋白具有重要的免疫炎性和保护原性，并且也有相关试验表明布鲁氏菌外膜蛋白与其毒力密切相关。Omp22，Omp25和Omp31作为布鲁氏菌重要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株，其特征在于：该菌株为猪种布鲁氏菌S2 Omp16ΔOmp16，于2019年12月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019991。/n

【技术特征摘要】
1.一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株，其特征在于：该菌株为猪种布鲁氏菌S2Omp16ΔOmp16，于2019年12月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：M2019991。


2.如权利要求1所述的一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、引物设计
利用PrimierPrimier5设计Omp16基因扩增引物、Omp16基因上下游扩增引物、骨架载体扩增引物、四环素诱导启动子扩增引物、氨苄霉素抗性基因扩增引物、筛选缺失Omp16基因鉴定引物和定量引物，引物序列如下：
pBBR1MCS5骨架载体扩增引物：
F1(5’-TTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTA-3’)
R1(5’-CCTCCCAGAGCCTGATAAAAACG-3’)
四环素诱导启动子扩增引物：
F2(5’-GCTCTGGGAGGCTGCAGCGGCCGTTTCCATTTAGGTGGGTAC-3’)
R2(5’-CTTATGTCAACTCGAGTTTTAAGCTTGCATGCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTTTCTCCTCTTTAATGAATTC-3’)
布鲁氏菌Omp16基因扩增引物：
F3(5’-GGTACCATGCGCCGTATCCAGTCGATTGCAC-3’)
R3(5’-AAGCTTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCCGTCCGGCCCCGTTGAGAA-3’)
Omp16上游同源臂
F4(5’-CTGCAGTTCGCAGATTGTCTTCACATC-3’)
R4(5’-TCTAGATCATATTGAGGTTAAAACAGGCT-3’)
Omp16下游同源臂
F5(5’-GGTACCATGCGCCGTATCCAGTCGATTG-3’)
R5(5’-GAATTCTACCCGATAGCCGACCGACCCT-3’)
氨苄霉素抗性基因鉴定引物：
F6(5’-TCTAGACGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTT-3’)
R6(5’-GGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3’)
突变子鉴定引物：
F7(5’-TGCTGCAACTTGAAACCGG-3’)
R7(5’-CTGGGTTTTTTGCAACTGGTT-3’)
Omp16qRT-PCR引物：
F8(5’-TCGATCTCGATTCGTCGCTG-3’)
R8(5’-CAAGGGCGAGGTTGTACTCA-3’)
S2、目的基因的PCR扩增及胶回收
分别以布鲁氏菌S2疫苗株基因组、PBBR1MCS5骨架载体和pG-KJE8载体为模板，用相应的引物进行PCR反应，扩增Omp16基因、骨架载体和四环素诱导启动子：
反应体系如下：5×PSBuffer5μL；dNTPMixture2μL；F0.5μL；R0.5μL；模板1μL；PrimestarDNApolymerase0.5μL；ddH2O15.5μL；
PCR反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性30s；58℃退火50s；72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；
将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在切胶仪下分别切取Omp16基因543bp、骨架载体3563bp和四环素诱导启动子1082bp目的条带胶块，使用天根生化科技公司生产的DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物；
S3、重组载体PZT-G+载体构建
将胶回收的骨架载体和四环素诱导启动子在PCR仪中37℃连接30min；连接体系如下：
骨架载体3μL；
四环素诱导启动子4μL；
5×CEIIBuffer2μL；

II1μL；
将连接后的产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，在超净工作台中，均匀的涂在LA固体平板上，将固体平板放置37℃恒温培养箱12h后，取出固体平板，用枪头挑出生长状况良好的菌落，将枪头打到加有20mLLB液体培养基的50mL离心管中，置于37℃恒温摇床中培养12h；之后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒提取pZT-G+重组载体；
将提取出的重组载体PZT-G+用HindIII和BamHI进行双酶切，使用天根生化科技公司生产的DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物；
S4、Omp16基因黏性末端的获取
将胶回收的Omp16基因连接上19T(simple)载体，连接体系如下：
目的基因1μL；19Tvector4μL；Solution15μL；
反应条件为：16℃连接2h；
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，放在37℃恒温摇床中复苏1小时后，在超净台里用枪吸取100μL的大肠杆菌感受态细胞DH5α滴加到已经预热到37℃的G+LA平板，涂布均匀，37℃条件下培养12小时后，用白色枪头挑选生长状态良好的单个菌落，打到装有20mLLB液体培养基的50mL灭菌离心管里，置于37℃恒温摇床中震荡培养12h，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取重组载体；
重组载体用19T(simple)-Omp16用HindIII和BamHI进行双酶切，并用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，胶回收Omp16基因；
S5、条件诱导载体pZT-G+-Omp16的构建
将双酶切后的pZT-G+重组载体和Omp16基因在如下反应条件和反应体系进行连接；
反应体系：
pZT-G+重组载体1μL；
Omp16基因4μL；
Solution15μL；
反应条件：16℃连接4h；
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，复苏1h，取100μL的复苏的菌液在超净台中涂布已经预热到37℃的G+LA平板，之后在37℃恒温培养箱培养12h，挑取平板上生长状态良好的单个克隆，在LB培养基里震荡培养12h后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取PZT-G+-Omp16重组载体；
将提取的PZT-G+-Omp16重组载体进行HindIII和BamHI的双酶切，并用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
S6、自杀载体PUC19-A+-Omp16的构建
分别将胶回收的Omp16上游同源臂(654bp)、Omp16下游同源臂(651bp)和氨苄霉素抗性基因(973bp)与19T(simple)载体进行连接，连接体系：目的基因1μL；19T(simple)vector4μL；Soluton15μL；连接条件是：16℃连接2h；
将连接产物转...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱华，支飞杰，周栋，靳亚平，田璐璐，陈蕾，李俊玫，张广冻，秦佩佩，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61